一种卷烟烟气总粒相物生物学评价的MTT细胞毒性试验方法技术

本发明专利技术涉及一种用于卷烟烟气总粒相物生物学评价的MTT细胞毒性试验方法，属于烟草及卷烟烟气安全性评价技术领域。其特征是：接种培养永生化人支气管上皮细胞（BEAS-2B细胞），并进行卷烟烟气总粒相物染毒，采用MTT法进行细胞存活率检测，根据试验结果分析评价卷烟烟气总粒相物的细胞毒性。相比现有技术，本发明专利技术具有以下特点：BEAS-2B细胞为人源细胞，是烟气作用于人体的靶器官来源细胞，采用BEAS-2B细胞系进行卷烟烟气的细胞毒性评价，针对性更强；试验过程中减少了多次洗涤细胞的步骤，也无需进行甲醛固定步骤，缩短了测试周期，使得操作更为快速简便，灵敏性更高，结果更加稳定可靠。此外，本发明专利技术所涉及的MTT测试方法，还适用于多种细胞系的烟气细胞毒性测试，通用性更强。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种卷烟烟气总粒相物生物学评价的MTT细胞毒性的试验方法，属于烟草及卷烟烟气安全性评价

技术介绍
卷烟烟气是由几千种化学物质组成的气溶胶，其中有部分化学物质已经确定为致癌物或辅助致癌物，吸烟与人类一些重要疾病的发生存在着密切的相关性。卷烟烟气的体外毒性试验研究已经成为评价吸烟对健康危害的有力手段，其中，体外细胞毒性试验在评价卷烟烟气以及低危害卷烟制品危害性方面起着十分重要的作用。进行卷烟烟气细胞毒性评价时采用的方法大多基于细胞存活率测定的原理。国际烟草科学研究合作中心(C0RESTA)推荐选用合适的哺乳动物细胞并采用中性红试验方法评价卷烟烟气总粒相物的细胞毒性。但中性红试验操作步骤较为烦琐，试验过程中的染色、及多个清洗步骤增加了误差的可能性。另外，目前国内外的相关研究通常采用啮齿类动物细胞系(如CHO细胞)进行中性红细胞毒性试验。而烟气主要毒性还是作用于人体，用动物细胞评价卷烟烟气总粒相物细胞毒性存在着一定的局限性。毒理学试验的最终目的是关注人类健康。针对卷烟烟气毒性较低的特点，在进行烟气的细胞毒性评价时，需要选择针对性强的细胞系以及灵敏度高的试验方法；同时在进行高通量样品的毒性检测时也要求测试方法能够更加简便、快速、准确。MTT (噻唑蓝)法，是一种广泛用于检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。用二甲基亚砜(DMSO)溶解细胞中的甲瓒并测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。与中性红法相比，该方法可省去一些清洗步骤，灵敏度高、操作简便。BEAS-2B细胞是永生化的人支气管上皮细胞，为烟气作用于人体的靶器官来源细胞，常用于呼吸道疾病的相关研究中。采用BEAS-2B细胞进行卷烟烟气的细胞毒性测试，更具针对性，可以较好地解决物种差异的问题。
技术实现思路
本专利技术的目的正是针对现有技术中所存 在的不足之处，而专门开发的一种用于卷烟烟气总粒相物细胞毒性的测试方法。本方法使用人支气管上皮细胞(BEAS-2B细胞)进行MTT细胞毒性试验评价卷烟烟气总粒相物的细胞毒性，不仅操作简便，灵敏度高，而且结果可以较为真实地反映卷烟烟气总粒相物的细胞毒性。本专利技术的目的可通过下述技术措施来实现:I)配制试验试剂: (1)细胞生长培养基:LHC-8培养基，使用前加入硫酸庆大霉素，终浓度为100单位/mL ； (2)消化终止液=DMEM-1640+ 10%胎牛血清； (3)0.01M 磷酸缓冲盐溶液(PBS):0.2 g KCl, 0.2 g KH2PO4,8 g NaCl, 2.9 gNa2HP0412H20，加超纯水至I L，pH 6.9 7.2，高压灭菌； (4)MTT溶液:称取250 mg MTT，放入小烧杯中，加50 mL PBS在电磁力搅拌器上搅拌30 min,用0.22 μm的微孔滤器除菌，分装，_20°C保存； (5)0.05%胰酶溶液:称取0.1g胰酶，加入200 mL PBS冰水浴搅拌30 min, 0.22 μπι的微孔滤器除菌，分装，_20°C保存； (6)十二烷基磺酸钠溶液:称取一定量的十二烷基磺酸钠溶解于无菌水中，使其浓度为10mg/mL,用0.22 μπι的微孔滤器除菌，4°C保存。2)细胞接种培养:扩增培养的处于指数生长期的人支气管上皮细胞(BEAS-2B细胞)经胰酶消化，制备单细胞悬液，计数后接种于96孔细胞培养板中，每孔I X IO4个细胞，置于培养箱(37°C，5% CO2)中孵育24 h。3)卷烟烟气总粒相物(TPM)染毒:移除96孔培养板中的溶液，设四类实验组，分别为:空白对照组、溶剂对照组、阳性对照组和烟气总粒相物组，并按下述要求在相应孔内加入细胞生长培养基、二甲基亚砜、十二烷基磺酸钠和烟气总粒相物的二甲基亚砜提取液样品。空白对照组不接种细胞，只加细胞生长培养基；溶剂对照组加二甲基亚砜，加入量与TPM组最高检测剂量相当；烟气总粒相物组加入不同剂量的烟气总粒相物二甲基亚砜提取液样品，使每mL细胞培养基中TPM的剂量依次是0、10、15、20、30、40、50、60、70 μ g ;阳性对照组加入十二烷基磺酸钠溶液。每孔内加入的细胞生长培养基和各种受试物的总体积均为200 μ L,继续置于培养箱中孵育24 h。4) MTT细胞毒性检测:向染毒24 h处理后的细胞培养板中直接加入MTT溶液，每孔20 μ L,置于培养箱中孵育4 h ;弃掉培养板中的溶液,加入DMSO溶液150 yL/孔,置于微孔板振荡器内震荡15 min ;在酶标仪上检测490 nm波长处的每孔吸光值。计算相对吸光值，相对吸光值代表细胞存活率。5 结果与分析:根据吸光值，按照公式(I)计算细胞存活率，并绘制卷烟烟气总粒相物暴露下细胞毒性的剂量-效应关系曲线。公式如下:本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种卷烟烟气总粒相物生物学评价的MTT细胞毒性试验方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：1)配制试验试剂，2)细胞接种培养，3)卷烟烟气总粒相物（TPM）染毒，4)MTT细胞毒性检测，5)结果与分析。

【技术特征摘要】
1.一种卷烟烟气总粒相物生物学评价的MTT细胞毒性试验方法，其特征在于:所述方法包括以下步骤: 1)配制试验试剂， 2)细胞接种培养， 3)卷烟烟气总粒相物(TPM)染毒， 4)MTT细胞毒性检测， 5)结果与分析。2.根据权利要求1所述的卷烟烟气总粒相物生物学评价的MTT细胞毒性试验方法，其特征在于:配制试验试剂有以下: (1)细胞生长培养基:LHC-8培养基，使用前加入硫酸庆大霉素，终浓度为100单位/mL ； (2)消化终止液:DMEM-1640+ 10%胎牛血清； (3)0.01M 磷酸缓冲盐溶液(PBS):0.2 g KCl, 0.2 g KH2PO4,8 g NaCl, 2.9 gNa2HPO4* 12H20，加超纯水至 I L，pH 6.9-7.2，高压灭菌； (4)MTT溶液:称取250mg MTT，放入小烧杯中，加50 mL PBS在电磁力搅拌器上搅拌30min，用0.22 μπι的微孔滤器除菌，分装，_20°C保存； (5)0.05%胰酶溶液:称取0.1g胰酶，加入200 mL PBS冰水浴搅拌30 min, 0.22 μπι的微孔滤器除菌，分装，_20°C保存； (6)十二烷基磺酸钠溶液:称取一定量的十二烷基磺酸钠溶解于无菌水中，使其浓度为10mg/mL，用0.22 μπι的微孔滤器除菌，4°C保存。3.根据权利要求1所述的卷烟烟气总粒相物生物学评价的MTT细胞毒性试验方法，其特征在于:细胞接种培养过程如下:扩增培养的处于指数生长期的人支气管上皮细胞(BEAS-2B细胞)经胰酶消化，制备单细胞悬液，计数后接种于96孔细胞培养板中...

【专利技术属性】
技术研发人员：毛健，李鹏，卢斌斌，孙世豪，谢剑平，张建勋，宗永立，
申请(专利权)人：中国烟草总公司郑州烟草研究院，
类型：发明
国别省市：