纽虫重组铁结合蛋白及制备方法技术

本发明专利技术公开了纽虫重组铁结合蛋白及制备方法，该纽虫重组铁结合蛋白的氨基酸序列如序列表SEQIDNO.1所示；该纽虫重组铁结合蛋白是从纽虫体壁中，通过RNA提取，cDNA合成，对cDNA的载体扩大培育得到阳性克隆质粒，阳性克隆质粒扩增、酶切后，与载体连接培育得到重组质粒，重组质粒培育后破碎及蛋白纯化得到纽虫重组铁结合蛋白；该方法得到的纽虫重组铁结合蛋白产量远远高于目前从动物肾脏提取的铁结合蛋白，用Ni-NTA得到的铁结合蛋白纯度较高，铁结合蛋白结合铁能力较好，还具有富集重金属和有机磷的作用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及重组铁结合蛋白，具体涉及纽虫重组铁结合蛋白及纽虫的体外重组铁结合蛋白的制备方法。
技术介绍
铁结合蛋白(铁蛋白)是 一种具有储存数千铁离子和数百磷分子能力的蛋白质，其分子结构被认为是由高度对称性亚基所组合的蛋白质，外壳可以包裹着由铁磷化合物组成的铁核。铁核结构起着供给和存储铁的“仓库作用”，铁蛋白的蛋白壳上含有两种横跨蛋白壳的隧道，即三相(X.Y.Z)物质交换隧道和电子隧道，前者的作用供无机磷铁及其他小分子进出，后者的功能起着接收及传递电子的作用。脊椎动物的铁蛋白由两种不同类型的亚基组成，即H和L亚基，L型亚基与H型亚基相互作用使氧化型铁矿化为一个铁核。。目前大部份是脊椎动物的重组铁蛋白，如申请号为CN为200510048963.X的专利技术专利申请就公开了利用基因工程技术，通过人乳铁蛋白基因的克隆、重组杆状病毒的构建、家蚕体内表达和人乳铁蛋白纯化得到重组人乳铁蛋白。也有无脊椎动物的重组铁蛋白，如公开号为CN102051363的专利技术专利申请，则公开了文蛤铁蛋白基因、编码蛋白、体外重组产物等，通过文蛤RNA提取和纯化、cDNA构建及铁蛋白基因的筛选、RACE获得铁蛋本文档来自技高网...

【技术保护点】
纽虫重组铁结合蛋白，其特征在于该纽虫重组铁结合蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ?ID?NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.虫重组铁结合蛋白，其特征在于该纽虫重组铁结合蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID N0.1 所示。2.权利要求1所述的纽虫重组铁结合蛋白的制备方法，其特征在于步骤如下: a、RNA提取:取纽虫体壁80-100mg速冻于液氮中,研磨成粉,用RNAisoplus提取试剂盒提取得到纽虫RNA，具体提取方法依照提取试剂盒说明书进行操作； b、cDNA合成:将纽虫RNA用cDNA试剂盒合成cDNA，具体合成方法依cDNA试剂盒说明书操作，得到cDNA文库质粒，然后用下述引物对合成的cDNA进行PCR扩增，上游引物的核苷酸序列为 AAGGGCATGA AGGTCCAAGA GGG,下游引物序列为 GTGGAAGCCA TCAGGGAA ； PCR扩增体系:CDNA文库质 粒1.0yL，10XPCR缓冲液2.5 μ L，浓度25mM的MgCl22.0 μ L，浓度IOmM的dNTP2.Ομ L，浓度10 μ M的上游引物1.0 μ L，浓度10 μ M的下游引物1.0 μ L，浓度5U/yL的 DNA聚合酶(λ 2μ L，超纯水:15.3μ L ;扩增条件:94°C 5 min、94°C 30 s、58°C 3sO、72°C Imin，共35个循环，最后72°C延伸10 min ;扩增反应后，用回收试剂盒回收PCR产物，然后PCR产物与载体pMD18-T连接，转化至大肠杆菌E.DH5 α后，在含有氨苄浓度为80-100mg/L的LB平板培养基中培养8_12h，挑取阳性克隆菌落，得到阳性克隆质粒； C、重组质粒:对上述阳性克隆质粒进行PCR扩增，扩增体系:上述阳性克隆质粒l.0yL, 10XPCR 缓冲液 2.5 μ L，浓度 25mM 的 MgCl2L 5 μ L，浓度 IOmM 的 dNTP2.5 μ L，浓度ΙΟμΜ的正向引物l.0yL，浓度ΙΟμΜ的反向引物l.0yL，浓度5U/yL的DNA聚合酶(λ 2μ L，超纯水 15.3μ L ;扩增条件:94°C 4 min, 94 °C lmin、58°C lmin、72°CImin，共35个循环，最后72°C延伸10 min ;其中正向引物的核苷酸序列为ACGCAAGCTTTTAAGAAGAG TTCCTT，反向引物序列为 ...

【专利技术属性】
技术研发人员：苏秀榕，周君，李晔，张春丹，李成华，刘艳，李振，张云云，
申请(专利权)人：宁波大学，
类型：发明
国别省市：