重组人源细胞珠蛋白在制备治疗脂肪肝药物中的应用制造技术

本发明专利技术公开了重组人源细胞珠蛋白在制备治疗脂肪肝药物中的应用。通过建立酒精肝大鼠模型，按rhCYGB3mg/Kg的剂量皮下注射，进行治疗，实验结果表明，重组人源细胞珠蛋白药物无毒性，与模型对照组相比，rhCYGB治疗组有显著的改善，其脂肪滴较模型组明显减少，肝索排列整齐。还原型谷胱甘肽治疗组仍有明显脂肪变性，肝细胞轻度肿胀。rhCYGB治疗酒精性脂肪肝比还原型谷胱甘肽药效更好。采用重组人源细胞珠蛋白治疗脂肪肝，特别是酒精性脂肪肝具有低毒、安全、有效的优点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及ー种蛋白的新用途，特别涉及ー种细胞珠蛋白的新用途。
技术介绍
饮酒是人类文明盛传已久的习惯之一，适量的饮酒对健康并无明显损害，甚至对冠心病等还有一定的预防作用。但是酒精滥用和酒精依赖影响了全球数百万人ロ，对社会和人类健康产生了许多不良影响。根据世界卫生组织报告全球范围内有20亿的酒精消耗，有约7 630万人被诊断为酒精滥用，毎年死于酒精滥用的人数已达到3.2%，有4.0%的人被疾病困扰。目前，在我国由于酒精所致肝损伤的发病率呈逐年上升趋势，酒精已成为继病毒性肝炎后导致肝损害的第二大病因严重危害了人类健康。因此，正确认识酒精性肝病，及时诊断和治疗，具有重要意义。酒精性脂肪肝是 由于长期大量饮酒导致的肝脏疾病，其发病机理存在多种假说，有人认为其是こ醇及其衍生物的代谢过程中直接或间接诱导的炎症反应，氧化应激、肠源性内毒素、炎性介质和营养失衡(尤其是蛋白质ー热量营养不良)等多种因素相互作用的结果，也有人认为酒精因素作为初次打击，通过氧化应激促使反应性氧化物増加，而诱发肝脏脂肪聚集。在氧化应激相关的脂质过氧化及炎性细胞因子的作用下，使脂肪变的肝细胞发生第二次打击，造成炎症、坏死和纤维化，但是并未有定论。此外，由于酒精性脂肪肝是ー种慢性病，而现有的酒精性脂肪肝普遍采用高度数酒精灌胃，对动物体的刺激大，同吋，灌胃对动物的刺激大，导致动物精神紧张，动物的神经系统及内分泌系统受到一定影响，得到的动物模型与真实发展而成的酒精性脂肪肝存在较大的区別，这也给酒精性脂肪肝的药物筛选带来了一定程度的影响。。酒精性脂肪肝的临床症状为非特异性，可无症状，或有右上腹胀痛、食欲不振、乏力、体质量减轻等。酒精性脂肪肝是ー种慢性病，一般认为其危害不大，但是其可进ー步发展为其他严重的肝病，影响人们的生命健康。酒精性脂肪肝的发生和发展存在种族、遗传、性別、年龄等差异，治疗效果也因人而异，未有成熟的治疗方案。目前治疗酒精性脂肪肝主要是通过戒酒及对症的药物治疗，如营养支持、降血脂、不饱和脂肪酸及磷脂类药物治疗等，但治疗效果不佳，有ー些药物的副作用明显；也有用抗氧化剂和抗内毒素治疗的，但也不能获得理想的效果，可能不能针对性清除激活的Kupffer细胞释放的炎性因子及活性氧成分；中药成分复杂，其有效成分难于确定，制备エ艺不够稳定，成品质量难以控制。至今仍没有有效且副作用小的治疗方法，因此，开发真正有效防治酒精性脂肪肝的药物，己经是当前迫切需要解决的问题。细胞珠蛋白(cytoglobin)是人体固有的保护性蛋白，对机体无毒副作用。细胞珠蛋白最初由Kawada等在大鼠HSC中发现，其在硫代こ酰胺胁迫诱导的纤维化肝脏星状细胞(HSC)中表达明显増加，因而起初被命名为HSC激活相关蛋白(Stellate cellactivation-associated protein, STAP)。蛋白测序表明它属于新的一类含血红素的六配位蛋白(Hexacoordinate globin super-family),是哺乳动物中四种球蛋白(Globin)之一。进ー步的研究发现STAP不仅存在于HSC中，还普遍存在于人类多种器官组织以及肾脏和胰脏的类成纤维细胞中，因而将其统ー称为细胞珠蛋白(Cytoglobin，Cygb).细胞珠蛋白由190个氨基酸残基组成，分子量是21.4KD，定位于染色体17q25。目前的研究表明Cygb具有过氧化酶的作用，活性氧清除剂的作用及一氧化氮加双氧酶功能，基因上具有保守的组织缺氧反应元件(HRE)，其3’ UTR同时还含有组织缺氧诱导的mRNA稳定信号(HIPBS)，可保证Cygb基因在组织缺氧时的表达和稳定性。在各种应激情况下如缺血、氧化应激及纤维化吋，Cygb表达增加。与球蛋白家族的其他成员一祥，Cygb具有保护细胞免受氧化应激的损伤，体内及体外实验表明外源性过表达rhCygb可保护肝星状细胞免受氧化应激损伤并且抑制其向纤维样细胞分化。由于人类Cygb与大鼠Cygb在基因序列上具有97%的同源性，故本实验采用来源于人的Cygb的rhCygb蛋白进行大鼠模型的治疗实验。迄今未有文献报导人源珠蛋白具有改善或治疗脂肪肝，特别是酒精性脂肪肝的功能。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供重组人源细胞珠蛋白在制备治疗脂肪肝，特别是酒精性脂肪肝药物中的应用。本申请专利技术人通过建立酒精肝大鼠模型，按rhCYGB 3 mg/Kg的剂量皮下注射，进行治疗，实验结果表明，重组人源细胞珠蛋白药物无毒性，与模型对照组相比，rhCYGB治疗组有显著的改善，其脂肪滴较模型组明显減少，肝索排列整齐。还原型谷胱甘肽治疗组仍有明显脂肪变性，肝细胞轻度肿胀。rhCYGB治疗酒精性脂肪肝比还原型谷胱甘肽药效更好。采用重组人源细胞珠蛋白治疗脂肪肝，特别是酒精性脂肪肝具有低毒、安全、有效的优点。附图说明图1是rhCYGB诱导表达后的SDS-PAGE电泳 图2是纯化后的rhCYGB的SDS-PAGE电泳 图3是造模30周后正常对照组与造模组大鼠肝脏组织HE染色结果 图4是治疗后各组大鼠肝脏组织HE染色結果。具体实施例方式下面结合实验，进ー步说明本专利技术。以上实验中，CYGB为细胞珠蛋白的缩写，rhCYGB为重组人源细胞珠蛋白的缩写。rhCYGB 的制备: rhCYGB的诱导表达:将PET28a-rhCYGB-BL21 (DE3)菌株用Kan+的LB培养液培养过夜，次日按1:100比例转入新鲜LB(Kan+)培养液中，当OD6tltl达0.6时，加入IPTG至终浓度为Immol/L，37°C诱导培养4 h收菌。经12% SDS-PAGE检测，电泳图如图1所示，图中，A:低分子量蛋白Marker; B: PET28a-rhCygb_BL21 (DE3)菌株表达产物；C:阴性空载体菌株PET28a-BL21(DE3)表达产物重组菌表达产物中在分子量约为21 kDa位置出现一条粗带(图1)。rhCYGB的纯化:将诱导表达的重组蛋白，经裂解洗涤后，用分子筛G25复性和初歩纯化，再经亲和层析柱进ー步纯化后，进行SDS-PAGE，电泳结果如图2所示，图中，A:低分子量蛋白Marker ；B:分子筛G25复性后产物；C:亲和层析纯化后的产物。用BandScan 5.0软件进行灰度分析，亲和层析纯化后的rhCYGB纯度为93.3%。rhCYGB的生物活性检测:按照T-AOC试剂盒的说明书对rhCYGB抗氧化活性进行检测和计算，纯化后的rhCYGB抗氧化活性为(95.58±2.67) U/mg (表I)，与两个对照组比较P=0.000，说明纯化后的rhCYGB具有抗氧化的生物活性。本文档来自技高网...

【技术保护点】
重组人源细胞珠蛋白在制备治疗脂肪肝药物中的应用。

【技术特征摘要】
1.组人源细胞珠蛋白在制备治疗脂肪肝药物中的应用。2.根据...

【专利技术属性】
技术研发人员：董文其，魏威，李珍，文健，
申请(专利权)人：董文其，
类型：发明
国别省市：