非放射性判别膜蛋白质转运功能的方法技术

非放射性判别膜蛋白质转运功能的方法，记录不同条件下ADP以及ATP显示的峰面积，根据ADP、ATP的峰面积得到它们在转运反应后的相对量，结合不同的转运反应时间点得到ADP/ATP的转运趋势，若随着反应时间的增加，ATP的含量趋于降低，相对的ADP的含量趋于上升，由此可判断该膜蛋白具备转运ADP/ATP功能。该方法优于以往研究膜蛋白转运功能的同位素示踪法，主要表现在其安全性，简便易行，以及成本低。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及膜蛋白质功能判别
，尤其涉及一类。
技术介绍
膜蛋白结构与功能的研究作为研究药物靶向性的基础对治疗疾病的发展是必不可少的。目前研究膜蛋白功能的普遍方法主要是以结构为基础的功能性研究，并且生物信息学技术作为核心方法被广泛的应用到对蛋白的结构以及功能方面进行预测。首先，通过在数据库中搜索目标蛋白的序列信息并且进行比对，包括同源序列，拓扑结构，功能团，进化，具体功能相关序列分析等。在预测结构的基础上，膜蛋白的功能研究还主要依赖各种现代生物物理仪器，包括质谱仪，核磁共振仪，X射线仪，红外/紫外/光散射光谱仪等。但是，由于膜蛋白不易于过表达，纯化甚至是结晶，再加上无法确保膜蛋白的天然构象，因此在其转运功能方面的研究还是面临很大的困难的。目前已经有很多文献通过应用放射性元素示踪的方法报道和研究了相关膜蛋白的转运功能，主要的研究方法是利用脂质体结构的特性模拟细胞膜结构，将目的蛋白插入到脂质体结构的表面。首先用做好的带有转运蛋白的膜结构包裹放射性元素标记的底物。在该混合物的基础上添加放射性元素标记的底物交换物。允许转运反应发生一段时间后应用蛋白抑制剂停止膜蛋白上的转运活动。最后，通过比较同位素标记的底物以及被交换物与各自标准含量的差别从而判断蛋白转运的情况。 同位素示踪法是利用放射性核素作为示踪剂对研究对象进行标记的微量分析方法，其主要原理是利用核探测器随时追踪放射性同位素不断地放出的特征射线，从而示踪同位素在体内或体外的位置、数量及其转变等。目前应用比较广泛的是放射性同位素法。该方法的优点在于其灵敏度高，测量方法简便易行，能准确地定量，准确地定位及符合所研究对象的生理条件等特点。稳定同位素因作为一种不释放射线的示踪剂，其灵敏度较低，可获得的种类少，而且价格较昂贵导致它的应用范围受到限制。就该方法的优点而言，膜蛋白上的转运活动的确能够准确的定位以及定量，但是，即便采取放射防护措施，放射性元素的对机体的损害也是难以避免的。操作者的损害程度与放射照射量，放射照射时间，以及放射射线种类都有直接关系。放射可以导致机体组织器官发生病变直至诱发癌变，并且会引发遗传缺陷。更重要的是放射性污物会污染环境进而影响他人的身体健康。除了健康隐患外，该方法不仅价格昂贵，操作需要的用量以及操作形式都需要谨慎。更重要的是该方法对实验环境的要求很高，需要在对周围环境没有污染的，严格密闭的条件下进行操作，并切配备先进的生物物理仪器。同位素失踪法已经为研究膜蛋白转运功能方面提供了不可小视的贡献，但是就该方法的推广性以及安全性而言，该方法也有它不可避免的弊端。除了同位素示踪法，另外一种被广泛应用研究膜蛋白转运功能的方法是通过检测在线粒体上转运后的物质与其他胞内物质反应后的生成物从而判断是否转运的方法。例如研究腺甘酸转运体(ANT4)转运ATP/ADP的功能，通过添加不同浓度的ADP，并且在不同浓度条件下检测NADPH的生成而判断ATP的生成。该方法虽然在体外水平能够保持天然膜蛋白的功能，但是实验准备条件苛刻，耗时长，需要大量培养细菌并且以及提取新鲜的线粒体。在大多数的哺乳动物细胞中，线粒体作为主要的ATP合成场所，通过线粒体内膜上的氧化磷酸化反应为胞质以及其他内源性器官提供能量。线粒体是是由外膜，内膜，膜间隙以及基质四个功能区构成的双模封闭的亚细胞器。内膜较外膜因含有高含量的蛋白质和心磷脂具有低通透性，并且其向内折叠的结构称作线粒体嵴，有关特异性分子运输，相关的氧化磷酸化反应以及ATP的合成都在内膜上发生。内膜仅允许不带电荷的小分子物质通过，大分子和质子需要特殊的转运系统。由内膜包裹的基质较细胞质基质黏稠，主要含有参与三羧酸循环、脂肪酸氧化、氨基酸降解等生化反应的酶等众多蛋白质。大约95%的细胞生命活动是由线粒体支持的。它主要是在结合能量代谢和自由基代谢的基础上把氧化底物产生的自由能转化为细胞可以利用的ATP形式。线粒体基质中的三羧酸循环和脂肪酸β-氧化过程生成NADH，通过在线粒体内膜上的电子传递链进行氧化磷酸化。而胞浆中糖酵解生成的NADH在苹果酸脱氢酶的作用下通过线粒体膜结构进入基质参与氧化呼吸链的反应。在合成ATP的过程中会产生少量活性氧自由基，这些氧化作用会导致膜转运孔道开放，使得外膜释放细胞色素C，自由基渗透到基质中损伤线粒体自身的DNA等。造成线粒体基质内的高渗透压，线粒体内外质子梯度消失，呼吸链脱偶联，从而使能量产生中断。同时，线粒体内的氧化应激对引起细胞凋亡起着决定性的作用，例如:外膜释放的细胞色素C可与凋亡因子结合形成凋亡体，内膜蛋白调控的紊乱以及胞浆钙水平升高均可引发细胞凋亡。线粒体还参与细胞中钙离子的缓冲。在其内膜电位的驱动下运输钙离子进入基质。当释放钙离子时产生的膜电位差能够激活一些第二信使系统蛋白协调诸如突触中神经递质的释放以及内分泌细胞中急速的分泌等。ANT是线粒体内膜上一种含量丰富负责转运ADP和ATP的载体蛋白。它通过参与偶联线粒体内膜上的氧化磷酸化过程催化转运内膜上生成的ATP与胞质中ADP的交换。ANT不仅是一种能量转运，而且它也是参与凋亡诱导的双重功能蛋白。它是组成线粒体膜通透性转换孔复合物 mitochondrial permeability - transition pore complex (PTPC)的主要组分，通过与Bcl2家族蛋白结合从而参与线粒体介导的细胞凋亡。ANT家族的蛋白共同包含一段能够识别并转运ATP和ADP的氨基酸序列RRRMMM。人类的ANT有四种异构体(ANT1，ANT2, ANT3和ANT4)，它们的表达是基于发育阶段，增殖状态，组织以及细胞类型的。已经有文献报道通过应用ANT抑制剂证明了 ANT的确能够转运ATP/ADP。ANT3在所有组织中广泛表达，并且表达量是直接与氧化代谢水平向关联的。ANTl在包括骨骼肌，心脏，以及大脑这些终端分化组织中高度表达。另外，ANT2只在未分化的细胞或组织中特异性表达，例如淋巴，肾脏和肝脏。最近已有文献报道ANT参与上调激素依赖性的癌症。过表达ANTl和3能够诱导细胞的凋亡，伴随膜电位降低，细胞色素C的释放，caspase被激活以及DNA降解。但是，ANT2缺乏这种特性。抑制ANT2的表达会导致细胞生长停滞以及线粒体膜电位升高。ANT4主要在肝脏，睾丸和脑组织中表达，该蛋白最早发现于哺乳动物以及雄性成年鼠的精细胞当中。并且它在鼠精原细胞无丝分裂过程中起着重要的作用。脂质体背景及工作原理 脂质体是一种人造微囊结构，在疏水作用下它的疏水部分聚集在一起避开水相，而亲水部分磷脂分子则暴露于水相使之形成圆形封闭的磷脂单或双分子层式囊泡结构。脂质体大小一般在25到IOOOnm之间，可以根据其组成成分，结构，所带电荷以及性能分为好多种。脂质体被广泛的用于生物化学以及制药方面，根据其可以与细胞膜融合的特性，脂质体可以作为药物载体包裹小分子药物，蛋白质，核苷酸甚至是质粒，再通过设计需要将药物送到细胞内部。脂质体的组成主要是磷脂和胆固醇。天然磷脂以卵磷脂(PC)为主，主要来源于蛋黄和大豆。其他合成磷脂例如二棕榈酰磷脂酰胆碱DPPC，二棕榈酰磷脂酰乙醇胺DPPE、二硬脂酰磷脂酰胆碱DSPC等均属氢化磷脂类，具有性质稳定，抗氧化性强，本文档来自技高网...

【技术保护点】
非放射性判别膜蛋白质转运功能的方法，其特征在于步骤为：将天然大豆蛋黄卵磷脂按照100mg/mL的比例溶于氯仿，用氮气均匀吹干溶液后，用超纯水再一次溶解析出的天然大豆蛋黄卵磷脂，并且超声得到天然大豆蛋黄卵磷脂的脂质体；将膜蛋白与上步经处理的天然大豆蛋黄卵磷脂混匀，添加底物ATP以及稳定脂质体结构的其他成分并摇匀，得到脂蛋白体重组混合物；按占总体积的比例，具体组成为：去污剂?10%wt?TritonX?114：8%，100mg/mL超声制备的微脂体：14%，10mg/mL心磷脂：8%，0.3μg/μL?膜蛋白：13%，0.1m?M?底物（ATP）：?1%，0.1M?PIPES?缓冲液：9%，?超纯水：?47%；将Amberlite?XAD?2大孔树脂与制备好的脂蛋白体重组混合物按照2:1的体积比例混合后放置摇床上摇匀15分钟，将混匀样品加入G75凝胶层析柱分离脂质体后，取样品与ADP按照10:1的体积比例进行转运反应；至少分三个时间点，用膜蛋白活性抑制剂：吡哆醛?5“?磷酸停止反应；将样品添加到G50凝胶层析柱上，进行转运反应后脂蛋白体的纯化收集；最后，将收取的脂蛋白体与乙醇以及氯仿按照1:2:6的体积比例混匀并且放置分层，取上层液400?600μL移至新无菌管后放置在4℃冰箱保存，得到包裹的ATP和ADP，再送至HPLC仪，应用HPLC仪分析得到在至少三个反应时间条件下ADP和ATP量的变化，在此基础上记录每个条件下ADP以及ATP显示的峰面积，根据ADP、ATP的峰面积得到它们在转运反应后的相对量，结合不同的转运反应时间点得到ADP/ATP的转运趋势，若随着反应时间的增加，ATP的含量趋于降低，相对的ADP的含量趋于上升，由此可判断该膜蛋白具备转运ADP/ATP功能。...

【技术特征摘要】
1.非放射性判别膜蛋白质转运功能的方法，其特征在于步骤为: 将天然大豆蛋黄卵磷脂按照100mg/mL的比例溶于氯仿,用氮气均匀吹干溶液后，用超纯水再一次溶解析出的天然大豆蛋黄卵磷脂，并且超声得到天然大豆蛋黄卵磷脂的脂质体； 将膜蛋白与上步经处理的天然大豆蛋黄卵磷脂混匀，添加底物ATP以及稳定脂质体结构的其他成分并摇匀，得到脂蛋白体重组混合物；按占总体积的比例，具体组成为:去污剂10%wt TritonX-114:8%, 100mg/mL 超声制备的微脂体:14%, 10mg/mL 心憐脂:8%,0.3 μ g/μ L 膜蛋白:13%，0.1m M 底物(ATP): 1%, 0.1M PIPES 缓冲液:9%，超纯水:47% ； 将Amberlite XAD-2大孔树脂与制备好的脂蛋白体重组混合物按照2:1的体积比例混合后放置摇床上摇匀15分钟，将混匀样品加入G75凝胶层析柱分离脂质体后，取样品与ADP按照10:1的体积比例进行转运反应；至少分三个时间点，用膜蛋白活性抑制剂:吡哆醒...

【专利技术属性】
技术研发人员：李冬海，张文，江雪源，张辰宇，
申请(专利权)人：南京大学，
类型：发明
国别省市：