用于转基因植物的蛋白质转运增强剂制造技术

用蛋白质转运增强剂处理可以促进和维持转基因植物中目的蛋白的表达和稳定性。优选，该转基因植物是已经改造而表达杀虫有效的蛋白的普通农作物。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及处理转基因植物，尤其是被设计表达杀虫有效的蛋白的农作物的方法。
技术介绍
转基因植物对商业化农业有重要影响，其利益很有前景但也产生了新的害虫控制问题。值得注意的是，基于用表达杀虫有效的晶体蛋白的基因改造的植物的农作物能通过使目标害虫的食物(植物组织)变得有毒而选择性消灭害虫，由此减少或消除化学杀虫剂的用量。属于芽孢杆菌属的革兰氏阳性菌的某些成员生产杀虫蛋白。了解最多的是苏云金芽孢杆菌(BT)，其中杀虫蛋白是晶体状小体和形成孢子的菌体。该杀虫晶体蛋白的特征是其对特定昆虫害虫(其中很多害虫对农业有重要影响)的效力和特异性，以及其对非目标昆虫种类和脊椎动物(特别是人)相对安全。这些杀虫晶体蛋白长期用于园艺业，其中像化学杀虫剂一样喷雾晶体和孢子的混合物，但对于范围较广阔的大田作物没有获得很大成功。该杀虫蛋白由基本无活性的大蛋白构成。当毛虫摄入了一些杀虫晶体时，该昆虫中肠的丙氨酸减少状态使该晶体分离和释放晶体蛋白。在此阶段该蛋白使无活性的，但是昆虫胃肠液中的特定酶将该蛋白剪切至其蛋白酶抗性的核，该核是完全活性的。活化的杀虫蛋白然后结合中肠内壁细胞的刷状缘膜，并插入细胞膜。当大约8个这样的插入集合在一起的时候，它们就形成穿膜的孔或通道，并允许细胞内容物泄漏，导致营养吸收所必须的细胞的死亡。昆虫迅速失去营养并最终饿死，或由于24小时内的次级细菌感染而死亡。晶体溶解，蛋白水解成活性杀虫蛋白和对特定受体结合的过程全都使该BT蛋白高度特异性并且对环境十分有利。已经收集了几千种不同的苏云金芽孢杆菌分离物并确定了其杀虫蛋白成分和活性谱。大量BT杀虫蛋白现已克隆并测序。为避免混淆，研究人员建议对晶体蛋白基因(Cry基因)使用同一的命名系统，根据其蛋白序列和其毒性所针对的昆虫类型。表1 由CryI基因编码的蛋白序列相似并仅对毛虫(也即蛾和蝶的幼虫，鳞翅目)有毒；CryII基因编码对鳞翅目和/或双翅目(苍蝇和蚊子)有毒而CryIV蛋白仅对双翅目有毒。CryIII基因生产对甲虫(鞘翅类)幼虫有毒的蛋白。考虑了不同蛋白之间序列的相似性和差异，在上述主要类型中进行了细分。CryI组，例如最初分成CryIA，IB和IC(尽管现在已经达到CryIG)，其中不同亚类可能在蛋白序列上只有50％同一。还进行了更细致的分类而CryIA现在包括CryIA(a)，IA(b)和IA(c)。开发了多种方法用于将目的基因导入农作物细胞并由此培育可育的植物。参见，美国专利6329574和http//www.cotton.pi.csiro.au/publicat/pest/transgen.htm，其内容在此全部作为参考而引用。所选方法部分依赖目标种类，而棉花改造经常依赖其植物遗传改造的自身发展的天然基因转移物。称为Crown Gall的疾病是一种有土壤细菌病源物，农杆菌引起的植物肿瘤。在1970年代早期，人们认识到该细菌通过转移部分其自身遗传物质到植物细胞DNA中而引起疾病。这些寄生的基因破坏被感染细胞的正常生化机器并使其制造仅细菌利用的新化合物。进一步研究之后，科学家能够鉴定那些基因导致疾病，并且由于细菌是很容易遗传操作的简单生物，他们用自己构建的潜在有用的基因取代了致病基因。然后这些细菌可以用于将基因从试管荷载至植物细胞中。然而不是所有的植物接触该细菌后最终都能得到该新基因。用抗生素纯化去除未改造的植物细胞。植物细胞对多种用于控制人和动物的细菌感染的抗生素敏感。如果能分离出使植物细胞对某种毒性抗生素具有抗性的基因，然后与某些目的基因物理连接并插入农杆菌，将可以提供杀灭未在感染中接受基因的那些细胞的选择系统。多年以来人们了解了那些使细菌对抗生素有抗性的基因，其通过生产分解或化学修饰而使抗生素无毒的酶而具有抗性。用上述的基因剪接技术，研究人员能改造编码解毒抗生素卡那霉素的酶的基因并生产了引起该酶在植物细胞中生产该酶的新的杂合基因而防止其在致死剂量的卡那霉素存在时死亡。结合这一抗生素筛选系统和植物组织培养步骤，有可能用农杆菌将基因引入多种植物，包括从矮牵牛到棉花。棉花是特别重要的作物。商品形式的转基因棉花使用CryIAc(Monsanto的BOLLGARDTM)和使用CryIAc和Cry2Ab基因(Monsanto的BOLLGARDTMII)的联合来表达苏云金芽孢杆菌的内毒素。大田效率表道表明50-70％控制害虫棉铃虫(helicover paarmigera)和澳洲棉铃虫(H.punctigera)。也很有价值的是用名为CryET33和CryET34的苏云金晶体毒性基因改造的农作物植物，所述基因编码对鞘翅目毒性的晶体蛋白CryET33(29-kDa)和CryET34(14-kDa)。CryET33和CryET34晶体蛋白对拟谷盗(red flour beetle)幼虫和日本金龟子(Japanesebeetle)幼虫有毒。(参见，美国专利6399330)转基因农作物的应用导致了对整体害虫控制的斗争中的新问题。一些问题涉及随植物成熟减少表达的内毒素，其导致在生长季节后期(棉花生长季的后1/3效率减少)和害虫可能产生对内毒素的免疫的可能性增加。这些缺点导致发展针对种植“窗口”，相对于本地害虫发育循环的害虫控制策略并且指定了杀虫剂应用的害虫群体最小域值。转基因植物的生理压力和物理损坏也导致内毒素蛋白质表达下降，相应的害虫控制效率降低。因此，长期干旱和/或高温能降低转基因作物中内毒素表达速率并是对害虫的防护显著下降，导致需要使用杀虫剂喷雾。内毒素蛋白表达下降的原因并不十分清楚。在BT棉花中，理论认为由于CMV3 5S启动子浓度减少，基因“沉默”或其它转录后事件，所以CryIAc基因表达下降。也有人认为CryIAc蛋白减少是因为植物内转化和扣押的增加，或者因为生长和衰老引起的稀释。人们理解在不成熟和成熟的BT棉花植物中CryIAc转录水平都不稳定。如果存在用于处理表达杀虫有效蛋白的转基因植物，而在植物成熟、生理压力和物理损坏时仍然促进这些蛋白表达的系统将是非常有利的。专利技术简述本专利技术的目的是提供处理表达杀虫蛋白的转基因植物，尤其是转基因作物的方法，且特别用于表达杀昆虫蛋白的转基因作物。本专利技术的另一个目的是提供延长表达的蛋白以足够量存在的时间的方法，所述量足以控制以被处理植物为食的有害昆虫。根据这些和其它目的，可以从本文看出，根据本专利技术的处理转基因农作物的方法包括对转基因植物的叶应用蛋白转运增强剂，所述叶表达杀虫有效的蛋白，所述增强剂促进被处理植物中杀虫有效蛋白的表达和/或稳定性。尽管不希望受理由限制，专利技术者认为该蛋白转运增强剂以下述一或多种方式作用(a)在有缺水压力时作物细胞膜的保护性水替代品的形式；(b)作为目的杀虫蛋白的蛋白质稳定剂；和/或(c)作为结合促进经过植物内转运机器的运动的蛋白的结合物。结果，尽管有缺水的生理压力和植物损伤，根据本专利技术处理的转基因作物表达杀虫蛋白并将其运至果实组织。专利技术者认为根据本专利技术的处理也将在植物生长和成熟中持续表达有效水平的杀虫蛋白。专利技术详述根据本专利技术用蛋白转运增强剂处理转基因植物，所述增强剂充分刺激和/或保护细胞表达和植物内转运机器使得尽管存在缺水、植物组织的物理损伤、生长和植物成熟，植物组织、果实和种子中维持所需本文档来自技高网...

【技术保护点】
维持转基因植物的杀虫效率的方法，该转基因植物包含表达杀虫有效的蛋白的基因，所述方法包括：　　　　用蛋白转运增强剂处理所述的转基因植物，该增强剂稳定所述植物中杀虫有效的蛋白的转运。

【技术特征摘要】
US 2002-8-1 60/399,716;US 2003-5-6 10/429,9741.维持转基因植物的杀虫效率的方法，该转基因植物包含表达杀虫有效的蛋白的基因，所述方法包括用蛋白转运增强剂处理所述的转基因植物，该增强剂稳定所述植物中杀虫有效的蛋白的转运。2.根据权利要求1的方法，其中所述转基因植物是棉花或玉米。3.根据权利要求1的方法，其中所述转基因植物是已经改造而表达苏云金...

【专利技术属性】
技术研发人员：J拉凯，
申请(专利权)人：LTA资源管理公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]