本发明专利技术公开了一种利用SSR分子标记对草本能源植物五节芒与荻的种间远缘杂交种进行快速鉴定的方法。选取植株的幼嫩叶片，蒸馏水清洗后采用常规CTAB法提取基因组DNA，基于PCR的SSR分子标记分析各个地区五节芒和荻分别具有的特异性条带，筛选出1对合适的SSR标记，该标记在五节芒中产生一个特异性条带（100bp左右），同时在荻中产生另一个特异性条带（123bp左右），而在两者的杂交后代中则表现为共显性，因此该SSR标记可用于五节芒与荻杂交后代的分子鉴定。利用本发明专利技术的方法可以快速准确地鉴定五节芒和荻的杂交种的真实性。本发明专利技术为五节芒与荻的杂交提供了一种操作简单、快速准确、重复性好、不受环境因素影响的鉴定方法。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于植物杂交种鉴定
，具体涉及一种芒属植物杂交种分子鉴定方法。
技术介绍
芒属植物(Miscanthus)为禾本科、多年生高大草本C4植物,作为最具发展潜力的能源植物日益受到关注。中国是芒属植物的起源与分布中心，具有丰富的野生资源、生态类型多。芒属植物适应性广、抗逆性强、产量高、净能产出高、生物质品质好、转化利用途径广、生态价值好等特点，适合在边际土地上种植利用，是一种兼具生态效益与经济效益的草本能源植物。芒属植物中的荻(Miscanthus Sacchariflorus)在我国东北、西北、华北及华东均有分布，抗逆性强，自然衰老，在耐盐碱方面表现显著，可作为改良盐碱的先锋植物，但生物质产量较低。五节芒(Miscanthus Floridulus)分布于长江中下游及以南区域,具有植株高大，生物质产量高，其茎及叶可为造纸原料，叶幼嫩时可做饲料，但抗旱、耐寒能力较弱，且不能自然衰老等特点。作为能源植物必须具备高生物质产量、高环境适应能力、低生产成本和产品的低含水量等特性，因此荻和五节芒单独作为能源植物的利用价值不大。开展五节芒和荻作的人工杂交研究，是利用荻和五节芒的各自优良性状，培育出抗逆性强、高产、广适应性等综合性状优良新品种的最佳途径。在我们前期的研究中发现芒属植物的自交结实率在不同基因型芒属植物中存在较大的差异，因此有可能在杂交种后代中存在自交苗，必须要准确的鉴定真假杂交种植株，避免在遗传分析和育种选择中出现 误差。形态学性状是杂交种鉴定的基础，尤其一些父本所特有的性状在杂种中的表现，是鉴别杂交种的重要形态学标记，但其鉴定耗时长，占用大量土地资源，形态学性状受环境影响等，不利于杂交种的快速鉴定。本专利技术方法利用SSR分子标记对芒属植物五节芒与荻人工杂 交种真实性进行鉴定，具有快速、准确、重复性好，不受环境因素影响等优点，为开展芒属植物分子育种奠定基础。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种高效快速的五节芒与荻杂交种的鉴定方法，该方法操作简便、具有快速、重复性好、不受环境因素影响、鉴定结果准确可靠，非常适合五节芒与荻杂交种群体的早期鉴定。本专利技术的目的是通过下述方式实现的:一种利用SSR分子标记对五节芒与荻杂交种进行快速鉴定的方法，包括以下步骤:I)基因组DNA的提取待测的五节芒与荻杂交种植株提取DNA ；2) SSR-PCR 反应加入HAU-170号引物进行SSR-PCR，引物序列如下:正向引物序列:5’-TGCATGGTTGCTTCAGCAGT-3’，反向引物序列:5’-ACAGAA ACCAATGCATGTGATGAG-3’ ；3)非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳PCR反应产物进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳；4)银染和条带分析。步骤I)的具体过程为:待测的五节芒与荻杂交种植株长到4-5叶时，采用CTAB法提取叶片DNA，所提取的DNA溶解于pH8.0的TE溶液中，4°C保存备用。步骤2)的SSR-PCR反应体系为:PCR 反应体积为 15 μ L，其中包括:10XBufferl.5 μ L, 25mmo1.171 的 MgCl2L 5 μ L，IOmmol.Γ1 的 dNTPs0.3 μ L，5U.μ Γ1 的 Taq 聚合酶 0.1 μ L, 20_25ng.μ Γ1 的 DNA 模板2yL,2ymol.L-1的引物1.5 μ L，超纯水补足；PCR反应程序为:94°C预变性5min，35个循环:94°C变性30s，54°C退火温度下复性30s，72°C延伸lmin，最后72°C延伸7min后4°C保存。步骤3)的具体过程为:PCR产物在非变 性聚丙烯酰胺凝胶电泳上检测，用IXTBE作为电泳缓冲液；在SSR-PCR产物体系中加入2 μ L的6X上样缓冲液混合，加入2 μ L至点样孔中，电泳2小时。步骤4)的具体过程为:固定:将电泳完的凝胶放入400mL的固定液中固定5min，然后用蒸馏水清洗一次；银染:在400mL的银染液中银染12min，然后用蒸馏水清洗一次；清底:在400mL的硫代硫酸钠溶液里面洗30s，变黄倒掉，用蒸馏水清洗一次；显影:然后将凝胶放入400mL的显影液中6 lOmin，待显出条带后再用蒸馏水清洗一次；终止:用400mL的终止液终止显影，在胶片灯下观察拍照；分析:在五节芒与荻杂交种植株中包含一个大小IOObp左右的特异性条带和一个大小为123bp左右的特异性条带；确定为真实杂交种。所述的五节芒与荻杂交种是利用湖南邵阳五节芒和陕西凤县的荻为亲本培育出的杂交群体。本专利技术提出的对五节芒与荻杂交种分子鉴定方法，利用特异性SSR引物，使得五节芒与荻的杂交种在苗期就可以进行快速鉴定。在特异性引物的筛选过程中，提取了全国不同地区五节芒和荻的DNA样本，材料分布范围广，验证了 HAU-170引物的广适用性。在五节芒和荻的杂交群体鉴定中，HAU-170号引物在杂交后代中表现出良好的互补性，且鉴定出的真杂交种植株在田间也被鉴定为真杂种。本专利技术为五节芒与荻的杂交种群体提供了一种操作简单、快速准确、重复性好、不受环境因素影响的鉴定方法。附图说明图1:五节芒与荻的HAU-170引物的标记结果；图2:利用HAU-170号引物进行杂交种群体鉴定的标记结果。具体实施例方式实施例1:引物筛选I)基因组DNA的提取选取各个地区的五节芒与荻及已获得的五节芒与荻人工杂交种植株(实验材料保存于湖南农业大学芒属植物资源圃)，待植株长到4-5叶时，选取幼嫩无病斑的叶片，用蒸馏水冲洗2 3遍，再采用常规CTAB法提取基因组DNA，溶解DNA的TE溶液pH值为8.0 ;4°C保存备用。待基因组DNA完全溶解后，DNA浓度用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测来确定。2 )基于PCR的SSR分子标记分析·PCR 反应体积为 15ii L，其中包括:10 X Bufferl.5 ii L，MgCl2 (25mmol.171)1.5u L,dNTPsdOmmol -L—1) 0.3 y L，Taq 聚合酶(5U u L-1) 0.1 y L，DNA 模板(20_25ng.u L-1) 2u L,引物(2 u mo1-LlLSiiL,超纯水补足。PCR反应程序为:94°C预变性5min，35个循环(94 °C变性30s，54°C退火温度下复性30s，72°C延伸lmin)，最后72°C延伸7min后4°C保存。反应在 Biometra Tgradient PCR 仪中进行。引物序列如下:正向引物序列:5’-TGCATGGITGCTTCAGCAGT-3’，反向引物序列:5’ -ACAGAA ACCAATGCATGTGATGAG-3'；3)非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳PCR产物在非变性聚丙烯酰胺凝胶(配方见表I)电泳上检测，用I X TBE作为电泳缓冲液。在SSR-PCR产物体系中加入2 ii L的6X上样缓冲液(0.25% (W/V)溴酚蓝，0.25%(W/V)二甲苯青FF，40% (W/V)蔗糖水溶液)混合，用IOii L的tip头加入2 y L至点样孔中，电泳恒定电压为200V，电泳2小时后，硝酸银染色。表I非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳配方本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种利用SSR分子标记对五节芒与荻杂交种进行快速鉴定的方法，其特征在于，包括以下步骤：1）基因组DNA的提取待测的五节芒与荻杂交种植株提取DNA；2）SSR?PCR反应加入HAU?170号引物进行SSR?PCR，引物序列如下：正向引物序列:5“?TGCATGGTTGCTTCAGCAGT?3“,反向引物序列:5“?ACAGAA?ACCAATGCATGTGATGAG?3“；3）非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳PCR反应产物进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳；4）银染和条带分析。
【技术特征摘要】
1.一种利用SSR分子标记对五节芒与荻杂交种进行快速鉴定的方法，其特征在于，包括以下步骤: 1)基因组DNA的提取 待测的五节芒与荻杂交种植株提取DNA ； 2)SSR-PCR 反应 加入HAU-170号引物进行SSR-PCR，引物序列如下: 正向引物序列:5’ -TGCATGGITGCTTCAGCAGT-3’， 反向引物序列:5’-ACAGAA ACCAATGCATGTGATGAG-3’ ； 3)非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 PCR反应产物进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳； 4)银染和条带分析。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于， 步骤I)的具体过程为: 待测的五节芒与荻杂交种植株长到4-5叶时，采用CTAB法提取叶片DNA，所提取的DNA溶解于pH8.0的TE溶液中，4°C保存备用。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于， 步骤2)的SSR-PCR反应体系为: PCR 反应体积为 15ii L，其中包括=IOXBufferL 5u L,25mmol I71 的 MgCl2L 5 u L,IOmmol L-1 的 dNTPs0.3u L,5U u L-1 的 Taq 聚合酶 0.1 y L, 20_25ng.u L-1 的 DNA 模板2uL,2umol L-1的引物1....
【专利技术属性】
技术研发人员：易自力，朱玉叶，艾辛，蒋建雄，
申请(专利权)人：湖南农业大学，
类型：发明
国别省市：
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