一种利用分子标记快速鉴定黄瓜砧木合力二纯度的方法技术

本发明专利技术涉及分子标记领域，提供了一种利用分子标记快速鉴定黄瓜砧木合力二纯度的方法，该方法采用专门设计的EST‑SSR引物，以合力二的基因组DNA为模板进行扩增，通过对扩增结果的特异谱带对待检测黄瓜砧木合力二的F1代种子纯度进行检测，采用这种方法可以在黄瓜砧木合力二植株生长的任何时期进行鉴定，能够将杂交种与母本自交种、父本自交种区分开来；准确性高，应用推广前景广阔，为开展砧木制种和良种的及时销售提供科学依据。

【技术实现步骤摘要】
一种利用分子标记快速鉴定黄瓜砧木合力二纯度的方法
本专利技术涉及分子标记领域，具体提供了一种利用分子标记快速鉴定黄瓜砧木合力二纯度的方法。
技术介绍
黄瓜砧木合力二号是山东省华盛农业股份有限公司最新培育的优良黄瓜砧木品种，该品种嫁接亲和力好，嫁接后黄瓜长势壮旺，抗病性增强。嫁接后瓜条黑亮顺直，提高了商品性。适宜保护地春秋及越冬种植。该品种在杂交制种过程中,母本需要人工去雄，授以父本花粉来完成杂交过程，母本去雄不彻底或漏去雄，都将会极大地影响制种纯度。因此鉴定杂交砧木种子纯度至关重要。传统的砧木杂交种子纯度鉴定工作仍然以田间种植鉴定为主，通过嫁接黄瓜外观形状比较鉴定，该方法鉴定一般需要2个月，时间长、费用高、难度大且准确性差，需要鉴定人员具有丰富的经验，且易受栽培措施和环境条件的影响，严重影响品种鉴定的效率及准确性，越来越不能满足现代育种工作和生产经营的需要。室内纯度检测通常采用分子标记技术，该技术从DNA水平上揭示子代与亲本间的遗传差异，不受环境条件和栽培措施的影响，无组织、器官及发育特异性，能够检测微小的变异，不受植株生长季节的限制，多态性丰富、稳定性高，可以大大缩短鉴定时间。现有技术中出现过采用三对引物运用多重PCR的方法进行南瓜纯度鉴定，但不能检测相应砧木纯度，且多重PCR体系复杂，所需时间较长，无法再短时间内获得鉴定结果，同时成本较高，难以在本领域广泛推广应用；因此如何利用该技术更好更快的实现对黄瓜砧木合力二纯度的鉴定成为亟待解决的问题之一
技术实现思路
本专利技术的专利技术人针对上述现有技术的情况，提供了一种利用分子标记快速鉴定黄瓜砧木合力二纯度的方法，该方法采用专门设计的EST-SSR引物，以合力二的基因组DNA为模板进行扩增，通过对扩增结果的特异谱带对待检测黄瓜砧木合力二的F1代种子纯度进行检测，采用这种方法可以在黄瓜砧木合力二植株生长的任何时期进行鉴定，能够将杂交种与母本自交种、父本自交种区分开来；准确性高，应用推广前景广阔，为开展砧木制种和良种的及时销售提供科学依据。本专利技术所针对的黄瓜砧木品种为合力二，合力二是山东省华盛农业股份有限公司经多年研究选育出的优良黄瓜砧木品种，该品种嫁接亲和力好，嫁接后黄瓜长势壮旺，抗病性增强。嫁接后瓜条黑亮顺直，提高了商品性。适宜保护地春秋及越冬种植。为了对合力二进行品种纯度的鉴定，获得母本和父本的优良杂交品种，本专利技术的专利技术人首先提供了一对EST-SSR引物，命名为HELI2，其正向序列为5’-GAATCAGAGGAAGGTTTGCG-3’，其核苷酸序列如SEQIDNo.1所示；反向序列为5’-CACTTCCTTCATGCTTCTCG-3’，其核苷酸序列如SEQIDNo.2所示，在获得上述引物之后专利技术人利用其对待测品种黄瓜砧木合力二的杂交种及其亲本的幼根基因组DNA进行了扩增，具体过程如下：(1)提取黄瓜砧木合力二杂交种及其亲本幼根基因组DNA；(2)以第(1)步提取的基因组DNA为模板，用EST-SSR引物HELI2进行PCR扩增：PCR反应体系为10μL，其中包括10×PCRBuffer1μL，0.2mMdNTPs，DNA模板100ng，引物各5μM，0.5UTaqDNA聚合酶，无菌超纯水补齐至10μL；扩增程序为：95℃预变性3min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸20s，35个循环；72℃终延伸5min；PCR产物保存于10℃；专利技术人经过多次试验后发现，针对本专利技术的专利技术目的，以及专门设计的特异性引物，扩增程序中将退火温度设置为55℃时，扩增效果最好，最终检测的结果更加贴近与实际情况，故而将本专利技术的退火温度设定为55℃。除此之外，与现有的其他类似扩增程序相比，专利技术人针对合力二进行品种纯度鉴定的要求，将预变性和变性温度提高到95℃，使得变性效果更好，同时将72℃延伸时间缩短，每个循环缩短了40s，使得整个鉴定过程更快，且对结果没有任何不良影响。(3)扩增产物检测：5μL扩增产物与2μL上样缓冲液混合，之后经丙烯酰胺质量体积比为8％的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，180v恒定电压电泳1.5h，银染显色进行带型统计；其中所采用的非变性聚丙烯酰胺凝胶中丙烯酰胺∶甲叉双丙烯酰胺的质量比为29∶1；所采用的上样缓冲液选自10×甘油凝胶上样液；(4)根据特异谱带的扩增结果鉴定“黄瓜砧木合力二”杂交种的纯度，判定标准为：母本具有177bp特异谱带,其核苷酸序列如SEQIDNo.3所示；父本具有159bp特异谱带,其核苷酸序列如SEQIDNo.4所示；杂交种具有159bp和177bp两条特异谱带；根据上述鉴定结果，可以换算黄瓜砧木合力二品种纯度(％)＝(1-n/N)×100％，其中N为待测砧木种子数目，n为单独具有父本谱带特征或单独具有母本谱带特征或既不同于“黄瓜砧木合力二”谱带特征也不同于父母本谱带特征的植株数目。上述方法中专利技术人并没有采用常规的叶片提取基因组DNA的方式，而是选用了幼根提取这样就大大缩短了材料生长时间，这是由于专利技术人经过多次试验后发现，针对本专利技术的专利技术目的，选取幼根可提取出适合纯度鉴定的基因组DNA，与叶片无差别甚至更加准确，但选取幼根会大大缩短材料准备时间，较之采用叶片提取基因组DNA的方式缩短了7天，同时提取幼根更加方便快捷。利用上述方法，即可实现对黄瓜砧木合力二品种纯度的快速检测，能够不受栽培措施和环境条件的影响；无器官、组织及发育特异性，该方法在植株生长的任何时期均可进行鉴定，同时将最低检测时限从叶片期降低到了幼根期，大大缩短了待测植株的培育时间；多态性丰富、共显性遗传：能够将杂交种与母本自交种、父本自交种区分开来；对DNA质量要求不高且需要量少；成本较低、操作简单；该方法在苗期即可进行鉴定，节省大量人力、物力和土地资源；重复性和稳定性较好；快速高效：一周之内即可完成种子纯度鉴定工作；准确性高：该方法从基因组水平上揭示子代与亲本间的遗传差异，克服了田间表型鉴定带来的误差；应用推广前景广阔：可以快速、准确检测“黄瓜砧木合力二”杂交种纯度。附图说明图1为本专利技术杂交种“黄瓜砧木合力二”种子检测特征引物的PCR电泳图谱，其中，P1为“黄瓜砧木合力二”母本；F1为多组“黄瓜砧木合力二”F1杂交种；P2为“黄瓜砧木合力二”父本，结果显示：“黄瓜砧木合力二”F1杂交种拥有分别来自父、母本的177bp和159bp的两条带；图2为不同PCR退火温度对“黄瓜砧木合力二”商品种子样品的纯度检测结果的影响电泳图谱；其中，P1为“黄瓜砧木合力二”母本；F1为“黄瓜砧木合力二”F1杂交种；P2为“黄瓜砧木合力二”父本，结果显示，最佳退火温度在55℃时，最易区分黄瓜砧木合力二杂交种纯度；图3为不同DNA模板量对“黄瓜砧木合力二”商品种子样品的纯度检测结果的影响电泳图谱，其中，P1为“黄瓜砧木合力二”母本；F1为“黄瓜砧木合力二”F1杂交种；P2为“黄瓜砧木合力二”父本，结果显示，DNA模板量从100ng至1000ng均可用于“黄瓜砧木合力二”商品种子样品的纯度检测。具体实施方式以下实施例中进一步定义本专利技术，根据以上的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本专利技术的基本特征，并且在不偏离本专利技术精神和范围的情况下，可以对本专利技术作出各种改变和修改，以使其适用各种用本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用分子标记快速鉴定黄瓜砧木合力二纯度的方法,其特征在于：利用EST‑SSR引物进行鉴定，所述的EST‑SSR引物命名为HELI2，其正向序列为5’‑GAATCAGAGGAAGGTTTGCG‑3’，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；反向序列为5’‑CACTTCCTTCATGCTTCTCG‑3’，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

【技术特征摘要】
1.一种利用分子标记快速鉴定黄瓜砧木合力二纯度的方法,其特征在于：利用EST-SSR引物进行鉴定，所述的EST-SSR引物命名为HELI2，其正向序列为5’-GAATCAGAGGAAGGTTTGCG-3’，其核苷酸序列如SEQIDNo.1所示；反向序列为5’-CACTTCCTTCATGCTTCTCG-3’，其核苷酸序列如SEQIDNo.2所示。2.根据权利要求1所述的利用分子标记快速鉴定黄瓜砧木合力二纯度的方法,其特征在于：具体步骤如下：(1)提取黄瓜砧木合力二杂交种及其亲本幼根基因组DNA；(2)以第(1)步提取的基因组DNA为模板，用EST-SSR引物HELI2进行PCR扩增：PCR反应体系为10μL，其中包括10×PCRBuffer1μL，0.2mMdNTPs，DNA模板100ng，引物各5μM，0.5UTaqDNA聚合酶，无菌超纯水补齐至10μL；扩增程序为：95℃预变性3min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸20s，35个循环；72℃终延伸5min...

【专利技术属性】
技术研发人员：袁晓伟，李兴盛，汪琳丽，
申请(专利权)人：李兴盛，
类型：发明
国别省市：山东,37