本发明专利技术涉及微生物生态学领域，旨在提供一种人体肠道微生态失衡与否快速评估试剂盒及测试方法。该试剂盒通过相对荧光定量PCR技术检测粪便中双歧杆菌与肠杆菌菌群水平比值，来评估肠道微生态失衡程度。方法如下：选定特异性最好扩增效率高的双歧杆菌与肠杆菌定量检测引物；计算双歧杆菌与肠杆菌DNA得率；微生物总DNA抽提；总DNA中双歧杆菌DNA和肠杆菌DNA相对定量检测；通过公式计算X值，根据X值评估肠道微生态失衡程度。本发明专利技术提供的试剂盒不但优化了双歧杆菌与肠杆菌定量检测条件而且具有快速，准确性好，灵敏度高的优点，可用于临床评价微生态调节剂的治疗效果，也可以指导临床消化系统功能紊乱症用药。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种人体肠道微生态失衡的快速评估试剂盒，属于微生物生态学领域。
技术介绍
人体肠道定居的微生物数量约IO14个，相当于人自身细胞数量的10倍，它们所携带的基因总数是人体所携带的基因总数的100倍。肠道微生物因其担任着机体营养物质代谢及免疫功能，而被公认为人体的一个重要器官。这些微生物按一定的比例组合，通过宿主与自身的调节机制在宿主肠道内达到一种动态的，相对平衡状态，对人体的健康起着重要作用。已公认肠道微生态的结构和功能的改变与宿主的肥胖，糖尿病、肠易激综合征(IBS)、炎性肠病(IBD)、肠癌等疾病相关。因此，肠道微生态平衡与否，是衡量人体肠道健康与否的标志，而有益菌与有害菌或条件致病菌的比例是衡量肠道微生态失衡与否的标准。吴仲文、李兰娟等曾用选择性培养的方法计算健康受试者、慢性重型肝炎患者肠道双歧杆菌与肠杆菌的比值，指出慢性重型肝炎患者肠道定植抗力下降。[吴仲文，李兰娟等，2001，慢性重型肝炎患者肠道定植抗力变化的研究，中华肝脏病杂志，6 (2) :329330]。此方法具有一定的误差，主要来源于部分肠道双歧杆菌不可培养性；厌氧培养条件的苛刻性，部分厌氧菌在操作过程中易暴露在空气中而死亡，选择性培养基上形成的菌落杂菌污染等。且双歧杆菌生长缓慢，耗时长且费力。鲁海峰、李兰娟等采用绝对定量方法计算受试者肠道双歧杆菌与肠杆菌的比值，该比值在一定程度上反映了随着病程的发展，肠道微生态失衡的严重程度。但其所使用的绝对定量方法涉及到双歧杆菌及肠杆菌标准品的制备及标准曲线的制作，且未考虑粪便标本中双歧杆菌与肠杆菌DNA的得率。[Lu H，Wu Z，Xu ff, Yang J, Chen Y, Li L,2011,Intestinal microbiota was assessed in cirrhoticpatients with hepati tis B virus infection. Microb Ecol61 :693-703 (乙型肝硬化患者肠道微生态结构的研究。微生态学杂志，61卷，693703页)]。在荧光定量PCR技术中，扩增曲线的Ct值，即达到荧光阈值所经过的循环数与待测DNA的拷贝数存在着线性关系，待测DNA扩增曲线的Ct值越小，其拷贝数越高。本专利技术则根据此原理，采用相对定量方法，即扩增曲线的Ct值比较法来间接计算受试者肠道双歧杆菌和肠杆菌菌群的比例，并以此估测肠道定植抗力的大小，具有简便、快速、且成本低等特点；另外本专利技术充分考虑到双歧杆菌菌体细胞壁及后期过柱纯化等因素对DNA得率的影响，在公式中引入DNA得率因子，SP在粪便标本中加入已知细胞数的细数量的任一种双歧杆菌，如婴儿双歧杆菌(B.1nfantis，ATCC15697，中科院微生物研究所)作内参，通过绝对定量计算双歧杆菌DNA得率EDNAbif，影响肠杆菌DNA得率主要为过柱纯化洗脱效率，EDNAe。。，=过柱纯化后DNA浓度/过柱纯化前DNA浓度。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是，克服现有技术中的不足，提供一种人体肠道微生态失衡与否快速评估试剂盒。该试剂盒不依赖于选择性培养技术直接从大便标本中抽提DNA，采用相对定量技术中的扩增曲线的Ct值比较法，计算人体肠道内双歧杆菌、肠杆菌菌群的比值，来评估肠道微生态失衡的状况。本试剂盒包括以下5个成份A 液2 X PCR预混液400 μ M dNTPs (脱氧核糖核苷三磷酸)3M MgCl2 (氯化镁)，Tris-HCl (三羟甲基氨基甲盐酸)，KCl (氯化钾)O. 2% Triton XlOO (聚乙二醇辛基苯基醚)，O. lmg/ml BSA(牛血清白蛋白),2U Pyrobest DNA 聚合酶20nM SYBR Green I (SYBR Green I 荧光染料)B液双歧杆菌引物引物浓度分别为O. 10 μ M双歧杆菌引物I 5/ GCG TCC GCT GTG GGC3/双歧杆菌引物2 5/ -CTT CTC CGG CAT GGT GTT G-3'C 液肠杆菌引物引物浓度分别为O. 10 μ M肠杆菌引物1:5' TGGGAGCGAAAATCCTG3'肠杆菌引物-2:5'-CAGTACAGGTAGACTTCTG3'D液测定粪便微生物总DNA抽提试剂盒，双歧杆菌DNA得率的标准品含有本专利技术所使用的双歧杆菌引物扩增出来的阳性产物的质粒10μ 1，其浓度为每微升IOltl拷贝。制作如下I)质粒制备采用本专利技术所使用的双歧杆菌引物扩增出来的阳性产物连接于T-easy载体(空载体来自Promega公司)，转化DH5 α大肠杆菌(TAKARA,中国大连),通过蓝白斑选择法确定阳性克隆菌；2)质粒增殖随机选择十个白色克隆菌，用分别用IOml液体LB(营养肉汤)培养液进行37°C，7h增殖，其中2ml用于测序鉴定，另3ml用于保存，余下的菌液采用市场上所使用的质粒抽提试剂盒进行质粒抽提和纯化3)质粒拷贝数计数纯化后的质粒采用`分光光度计测定其质量浓度，根据以下公式计算其拷贝数浓度。麗顚臟髓=懸變懸_禮X ,02X妒 鐘議齡分子量X IOi即质数拷贝数浓度=质粒质量浓度(ng/ μ I) X1. 69 X 101°4)根据计算的结果，将所纯化的质粒浓度调整为每微升IOltl拷贝，每10 μ I分装做为成品。E液标准品释释液TE缓冲液TIRS-HC1 (IOmM)，EDTA(乙二胺四乙酸，ImM)，PH8. O。本专利技术的上述目的可以通过如下技术方案来实现，抽提和纯化DNA是最关键。1、粪便DNA抽提和纯化是整个实验中最为关键的步骤。本专利技术直接提取受试者的一定量的新鲜大便(约IOOmg)中微生物的混合的总的基因组DNA，提取方法采用改良的Qiagen大便DNA抽提试剂盒(货号51504)抽提法，即增加机械及物理破壁步骤。具体操作步骤如下(I)称取新鲜大便100毫克于厚玻壁管(管内已有300毫克O.1毫米玻璃珠)中，加入1400毫升ASL (Qiagen大便DNA抽提试剂盒)，置于均质器中；(2)采用均质器6 800rpm，45秒，取出冰浴5分钟，再水浴95°C，10分钟，再次置于均质器中，5000rpm, 20秒，取出冰浴5分钟，再水浴95°C，10分钟；冰浴5分钟；冰浴结束后取出，离心，取上清；所获得的上清要进行DNA纯化及处理，其步骤详见粪便DNA试剂盒说明书；DNA纯化后洗脱体积约100 μ I，每次取2 μ I用于Q-PCR反应。2、双歧杆菌，肠杆菌特异性引物的选定。通过文献搜索到七对双歧杆菌,五对肠杆菌特异性引物,从中选择最适合的一对双歧杆菌，肠杆菌引物。通过本专利技术试剂盒的A液对10份双歧杆菌检测阳性的粪便总微生物DNA进行相对荧光定量PCR检测，分析扩增曲线及扩增产物的熔解曲线，及扩增产物的普通琼脂糖电泳图选择扩增效率最高，特异性最好的双歧杆菌引物，结果见图1。通过本专利技术试剂盒的A液对肠杆菌检测阳性的粪便总微生物DNA进行荧光定量PCR检测，分析扩增曲线及扩增产物的熔解曲线，及扩增产物的普通琼脂糖电泳图选择扩增效率最高，特异性最好的肠杆菌引物，结果见图2。3, DNA试剂盒革兰阳性细菌细胞DNA得率EDNAbif，革兰阴性细菌细胞DNA得率EDNAec。本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种人体肠道微生态失衡与否快速评估试剂盒，其特征在于，包括以下成分：A液：2×PCR预混液：400μM?dNTPs3M?MgCl2，Tris?HCl，KCl0.2％Triton?X1000.1mg/ml?BSA2U?PyrobestTM?DNA聚合酶20nM?SYBR?Green?IB液：双歧杆菌引物：引物浓度分别为0.10μM双歧杆菌引物1：5′?GCG?TCC?GCT?GTG?GGC3′双歧杆菌引物2：5′CTT?CTC?CGG?CAT?GGT?GTT?G3′C液：肠杆菌引物：引物浓度分别为0.10μM肠杆菌引物1：5′TGGGAGCGAAAATCCTG?3′肠杆菌引物2：5′CAGTACAGGTAGACTTCTG?3′D液：测定粪便微生物总DNA抽提试剂盒，双歧杆菌DNA得率的标准品：含有前述B液中双歧杆菌引物扩增出来的阳性产物的质粒10μl，其浓度为：每微升1010拷贝；E液：标准品释释液：TE缓冲液：TIRS?HCl10mM，EDTA1mM，PH8.0。
【技术特征摘要】
1.一种人体肠道微生态失衡与否快速评估试剂盒，其特征在于，包括以下成分A液2 X PCR 预混液:400 μ M dNTPs3M MgCl2, Tris-HCl, KClO. 2% Triton XlOOO. lmg/ml BSA2U Pyrobest DNA 聚合酶20nM SYBR Green IB液双歧杆菌引物引物浓度分别为ο. 10 μ M双歧杆菌引物 I 5/ -GCG TCC GCT GTG GGC3/双歧杆菌引物 2 5/ CTT CTC CGG CAT GGT GTT G3'C液肠杆菌引物引物浓度分别为O. 10 μ M肠杆菌弓丨物1:5' TGGGAGCGAAAATCCTG-3'肠杆菌弓丨物 2 :5' CAGTACAGGTAGACTTCTG-3'D液测定粪便微生物总DNA抽提试剂盒，双歧杆菌DNA得率的标准品含有前述B液中双歧杆菌引物扩增出来的阳性产物的质粒10μ 1，其浓度为每微升IOltl拷贝；E液标准品释释液TE 缓冲液TIRS-HC110mM，EDTAlmM, PH8. O。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述D液的制作步骤为(1)质粒制备采用本发明所使用的双歧杆菌引物扩增出来的阳性产物连接于T-easy载体，转化DH5a大肠杆菌，通过蓝白斑选择法确定阳性克隆菌；(2)质粒增殖随机选择十个白色克隆菌，用分别用IOml液体LB培养液进行37°C，7h增殖；其中2ml用于测序鉴定，另3ml用于保存，余下的菌液采用市场上所使用的质粒抽提试剂盒进行质粒抽提和纯化；(3)质粒拷贝数计数纯化后的质粒采用分光光度计测定其质量浓度，根据以下公式计算其拷贝数浓度；X 6.02 XIO23薩_雜分子邐X _即质数拷贝数浓度=质粒质量浓度(ng/ μ I) X1. 69 X 101°(4)根据计算的结果，将所纯化的质粒浓度调整为每微升IOltl拷贝，每10 μ I分装做为成品。3.基于权利要求1所述试剂...
【专利技术属性】
技术研发人员：李兰娟，鲁海峰，吴仲文，杨介钻，张华，陈燕飞，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：
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