甘薯黑腐病菌分子检测引物及其应用制造技术

本发明专利技术提供一种甘薯黑腐病菌分子检测引物及其应用，该特异引物：上游引物DyB1F：5‘-TTCATCGTCAGGAATACCG-3’；下游引物DyB2R：5‘-GACCTTGGCTTTCTTGCTGTA-3’；经过PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳，可在甘薯黑腐病菌纯DNA、带菌的发病植株组织和土壤中扩增出片段长度为509bp的特异扩增产物，对甘薯黑腐病菌进行快速检测；本发明专利技术的特异分子检测引物及其用法可被用于生产实践中带菌土壤、病残体、发病植株和种苗中甘薯黑腐病菌的快速、灵敏、特异的检测，同时可用于田间病害的早期诊断和病菌的监测和鉴定，为甘薯黑腐病菌引起的病害的防治提供可靠的技术和理论依据。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于农作物病害检测、鉴定及防治技术的领域，更具体涉及一种甘薯黑腐病菌分子检测引物及其应用。
技术介绍
甘薯(Ipomoea batatas (L. )Lam.)是世界粮食、能源和工业原料作物之一,我国是全球最大的甘薯种植国。甘薯黑腐病是由侵染引起的一种病害,可以严重为害甘薯的茎和根，造成大量死苗，严重影响甘薯的生产。方树民于1991年报道了福建省莆田、惠安和晋江等地区发生甘薯细菌性黑腐病，病原鉴定为份sp.，受害损失严重的达80 %以上。2003年罗克昌对该病的危害和流行进行了调查，发病严重的病株率达50%，死株率可达35%。2011年黄立飞等报道广东的广州、惠州、湛江、增城、海丰、博罗、惠东等市县发生黑茎病，病原鉴定为份chrysmthemi。两省报道的病害症状相似，为明确该病病原，近两年来我们在广东、广西、海南、福建等省大量采集类似症状的病害样本进行病原菌的分离鉴定，经过对100多株的病原菌进行比较，各地黑色腐烂的甘薯茎上分离的强致病细菌在生理生化上相似，16S rDNA和16S-23S rDNA间隔区序列(ITS)的同源性均达99%以上，应为同一种病原菌。Blast比较表明其16S rDNA的序列与Dickey属菌株的同源性最高，进一步与Dickey属中5个种的模式菌株的16S rDNA比较发现，这些菌株的16S rDNA序列与模式菌株的同源性最高，达99. 5%以上。在各地病害样本分离的过程 中，发现很多(约有30%)黑色腐烂的植株中并未分离到致病细菌，但可分离获得大量的非致病细菌，可能是机械损伤或受生理原因或虫害等其他原因造成植株受害后腐生细菌进入植株引起发黑腐烂。分离结果表明有很多种类细菌的腐生可引起组织发黑，给准确进行病害的鉴定造 成了困难。目前尚没有针对此菌的检测技术开发，只能通过传统技术进行分离鉴定。为了能够正的撑握病害的发生情况，及时采取相应措施进行防控，需要快速确定田间具有症状样本是否为流行性病原引起，而传统的病原细菌鉴定方法需要较长的时间，为了给生产应用提供更加快速、可靠的检测方法，本专利技术根据细菌的gyrB基因序列设计引物建立了甘薯黑腐菌PCR检测方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种甘薯黑腐菌分子检测引物及其应用，针对现有技术对甘薯黑腐菌的生物学检测方法所需周期长、目前又还没有关于甘薯黑腐菌分子及其他快速检测方法，提供一种甘薯黑腐菌的特异性分子检测引物。实现本专利技术的目的包括下列步骤1.根据甘薯黑腐病基因序列特异性，设计了对甘薯黑腐病菌具有特异扩增作用的一对PCR引物，即特异分子检测引物的序列为 上游引物 DyBlF: 5 ‘-TTCATCGTCAGGAATACCG -3’下游引物 DyB2R : 5 ‘ -GACCTTGGCTTTCTTGCTGTA-3，2.甘薯黑腐病菌特异分子检测体系的建立 (O从被甘薯黑腐病菌感染的植株或存在甘薯黑腐病菌的土壤中提取黑腐病菌的DNA ； (2)PCR扩增PCR反应体系25 μ L，所述PCR反应体系为2. 5 μ L IOXPCR反应缓冲液，2. 5 mmol/L Mg2+，100 400 μ mol/L dNTPs,1. 25U Taq DNA 聚合酶，引物 DyBlF 和 DyB2R各O. 2 ymol/L和10 100 ng模板DNA，其余为ddH20 ;PCR反应条件为94 °C预变性4 min，94 °C变性 35 s，52 64°C退火 35 S，72 °C延伸 40 S，循环 30 次，72 °C延伸 5 min ； (3)然后取31μ L PCR产物用重量浓度1. 0%琼脂糖电泳分离，经溴化乙锭染色后于紫外灯下根据扩增产物的大小判定结果。(4)如果能特异性地扩增出509 bp产物时，即可判断所述的样品中存在甘薯黑腐病菌；否则所述的植株或土壤样品中不存在甘薯黑腐病菌。所述步骤(I)中从被甘薯黑腐病菌感染的植株组织中提取DNA采用DNA快速提取法获得发病组织中的甘薯黑腐病菌的DNA，所述DNA快速提取法的具体方法为取300 mg茎组织，用医用手术剪刀剪碎，加入I mL浓度为O.1 mol/L、pH为8. O的Tris-HCl缓冲液，静置15 min, 3000 rpm离心2 min,取出上层液体至另一新的1. 5 mL Eppendorf管，12000 rpm 离心 2 min，弃上清，加 50 μ L 浓度为 O.1 mol/L、pH 为 8. O 的 Tris-HCl，缓冲液，置旋涡振荡器上将沉淀物振荡成悬浮液，置沸水中煮8 min, 12000 rpm离心5 min，取5 μ L上清液加入到495 μ L浓度为O.1 mol/L的Tris-HCl，pH为8. O缓冲液中，混均即可用于PCR反应。所述步骤(I)中从存在甘薯黑腐病菌的土壤中提取黑腐病菌DNA的具体方法如下取I g经研磨的土壤粉末，置10 mL离心管中，加2 mL磷酸钠缓冲液(0. 12 mol/L,pH 8. 0),混合,放 30°C 摇床上，150 r/min,摇动 15 min。8 000 r/min,离心 10 min,取沉淀。重复上述操作，取沉淀。加入3. 7 mL DNA提取液(100 mmol/L Tris-HCl, 100 mmol/LEDTA, 100 mmol/L 磷酸钠，1. 5 mol/L NaCl, 0. 01 g/mL CTAB, ρΗ8· 0，混合，再加入 10 μ L蛋白酶K(20 mg/mL )，于225 r/min摇床上37°C摇动30 min，接着加入0. 3 mL重量浓度为20% SDS，65°C水浴2 h，每隔15 20 min轻轻颠倒几下，室温12 000 r /min离心5 min,收集上清，转移到一新的10 mL离心管中，土壤沉淀再加入0.9 mL提取液和0.1 mL重量浓度为20%的303，涡旋108，65 °C水浴10 min，室温12 000 r /min离心5 min，收集上清液与上次上清液合并。重复上述操作，收集上清液与前两次上清液合并。上清液与等体积的氯仿、异戊醇混合液混合，所述混合溶液中氯仿异戊醇的体积比为24 1,12000 r/min离心5 min，吸取水相转移至另一新的10 mL离心管中，加入0.1体积的3 mol/L NaAC溶液和0. 6倍体积的异丙醇，一 20 °C沉淀I h,室温12000 r /min离心5 min,收集核酸沉淀，加入700 μ L体积浓度70%的一 20°C乙醇进行洗涤，12000 r /min离心5 min，倾掉上清，在超净工作台上自然晾干无酒精味后用I X TE溶液进行溶解，得到DNA溶液，用紫外分光光度计检测DNA浓度并稀释至50 ng/mL待用。本专利技术的关键性技术是甘薯黑腐病菌的高效特异扩增的引物序列及其扩增方法。为了获得甘薯黑腐病菌的特异引物序列，本专利技术以我国福建、广东、广西、海南等省市分离获得的45株甘薯黑腐病菌和甘薯青枯病菌、甘薯健康植株和腐烂植株中分离的多个菌株、多个其他植物病原细菌菌株、欧氏杆菌的一些种以及常见的几种细菌为供试材料，采用CTAB-SDS法提取供试菌株基因组DNA，具体方法如下 取供试菌株细菌培本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种甘薯黑腐病菌分子检测引物，其特征在于：所述甘薯黑腐病菌分子检测引物的序列为：DyB1F：5‘?TTCATCGTCAGGAATACCG??3’?DyB2R：5‘?GACCTTGGCTTTCTTGCTGTA?3’。

【技术特征摘要】
2012.11.12 CN 201210448667.91.一种甘薯黑腐病菌分子检测引物，其特征在于所述甘薯黑腐病菌分子检测引物的序列为DyBlF 5 ‘-TTCATCGTCAGGAATACCG -3’DyB2R 5 ‘-GACCTTGGCTTTCTTGCTGTA-3’。2.根据权利要求1所述的甘薯黑腐病菌分子检测引物，其特征在于所述甘薯黑腐病菌分子检测引物DyBlF和DyB2R对甘薯黑腐病菌特异性扩增出509 bp的产物。3.根据权利要求2所述的甘薯黑腐病菌分子检测引物，其特征在于所述甘薯黑腐病菌分子检测引物的特异引物序列获得方法为以甘薯黑腐病菌、甘薯青枯病菌、甘薯健康植株和腐烂植株中分离的多个菌株、多个其他植物病原细菌菌株、欧氏杆菌的一些种以及常见的几种细菌为供试材料，采用CTAB-SDS法提取各供试菌株基因组DNA，具体方法如下取供试菌株细菌培养液1. 5 mL加入至Ij1. 5 mL Eppendorf管中，12000 rpm,离心2 min ;弃上清液，加入500 mL 1XTE，用枪头反复吹打混匀；加入5 mL浓度为20 mg/mL的蛋白酶K， 30mL重量浓度10% SDS，轻轻混匀，37°C水浴锅放置I h ;待菌液变透明后，加入100 mL 5 mo I/L NaCl混匀，加入80 mLCTAB提取液，轻缓地颠倒离心管数次使样品充分混匀，65°C水浴放置10 min;冷却后加715 mL酚、氯仿和异戊醇混合溶液，所述混合溶液中酚氯仿 异戍醇的体积比为25 24 I,轻柔颠倒数次，12000 rpm离心5 min ;小心吸取上清至另一新的1. 5 mL Eppendorf管,加入与吸取上清液等体积的上述酹、氯仿和异戍醇混合溶液, 颠倒混勻；12000 rpm离心5 min,小心吸取上清至另一新的1.5 mL Eppendorf管,加入与吸取上清液等体积的无水乙醇，轻柔颠倒数次混匀，-20 °C放置30 min, 12000 rpm离心5 min，弃上清，加入I mL 70%乙醇洗涤沉淀两次，在超净工作台中晾干沉淀，无酒精味后加入100 mL I X TE溶液进行溶解，得到DNA溶液，用紫外分光光度计检测DNA浓度并稀释至 50 ng/μ L，保存于_20°C备用；在PCR获得甘薯黑腐病菌特异DNA序列片段的基础上应用 ClustalX软件比对设计特异引物，获得甘薯黑腐病菌分子检测引物特异引物序列，经对供试菌株和45株甘薯黑腐病菌的特异性进行PCR验证，所述特异引物在甘薯黑腐病菌上特异性地扩增出509 bp的产物。4.根据权利要求3所述的甘薯黑腐病菌分子检测引物，其特征在于所述CTAB提取液为重量浓度 10% CTAB, 100 mmol/L Tris-HCl, pH 8. O ；20 mmol/L EDTA, ρΗ8· O ；0. 7 mol/ L NaCl。5.根据权利要求3所述的甘薯黑腐病菌分子检测引物，其特征在于所述IXTE溶液为 10 mmol/LTris-HCL,0.1 mmol/LEDTA, pH 8.O。6.根据权利要求3所述的甘薯黑腐病菌分子检测引物，其特征在于所述对供试菌株和45株甘薯黑腐病菌的特异性进行PCR验证的具体反应体系是PCR反应体系25 μ L，包括 2. 5 μ L 10XPCR 反应缓冲液，2. 5 mmol/L Mg2+，100 400 μ mol/L dNTPs,1. 25U Taq DNA 聚合酶，引物 DyBlF 和 DyB2R 各 O. 2 μ mol/L 和 30 ng 模板 DNA, ddH20 补足 25 μ L, PCR反应条件为94°C预变性4 min, 94 °C变性35 S，52 64°C退火35 s，72 °C延伸40 s，循环30次，72 °C延伸5 min。7.—种如权利要求1、2、3、4、5或6所述的甘薯黑腐病菌分子检测引物的应用，其特征在于所述的甘薯黑腐病菌分子检测引物应用于甘薯黑腐病菌的快速分子检测诊断，按照以下步骤检测(1)从被甘薯黑腐病菌感染的植株...

【专利技术属性】
技术研发人员：邱思鑫，刘中华，邱永祥，徐永清，余华，
申请(专利权)人：福建省农业科学院作物研究所，
类型：发明
国别省市：