一种用于驴精液冷冻保存的鸭蛋卵黄抗冻剂及其制备方法技术

本发明专利技术提出了一种用于驴精液冷冻保存的鸭蛋卵黄抗冻剂及其制备方法，每100mL抗冻剂中包括下列组分：Tris?3～4g、葡萄糖1～2.5g、柠檬酸1.5～3.0g、甘油5～10mL、卵黄10～30mL、青霉素45～55万IU、链霉素4.5～5.5万IU、余量为蒸馏水，解决了现有技术中母畜繁殖周期长、人工授精受胎率低，驴的冷冻精液生产操作程度复杂，难度大的问题。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，特别是指。
技术介绍
精液冷冻保存与人工授精技术相结合，在现代畜牧业生产中发挥着巨大的作用，能大量减少公畜的饲养数量，降低生产成本，提高优秀种公畜的利用率，为畜牧业带来巨大的经济效益。现阶段，驴繁殖主要采用本交方式，个别技术好的畜牧改良员有时也将采出的精液(鲜精)不稀释或低倍稀释(I 2 4)，立即给发情母驴输精，它适用于母驴季节性发情较明显，而且数量较多的地区。与本交相比，效率可提高5 — 20倍。但由于我国驴品种较多，养殖区分布较广，多在山区或交通不便区域，且饲养方式多以散户居多，母驴分布不集中，鲜精或低倍稀释的精液人工授精技术推广面积较少。此外，由于驴鲜精体外保存时间极短，几小时后活力近乎丧失，这使得驴的鲜精人工授精技术受到时间、地点的极大限制。因此，畜牧生产中迫切需要保存时间更长、携带更为方便的优质公驴精液来改良全社会的驴生产群体。精液保存分为常温(15 °C 25 °C)保存、低温保存(0°C 5°C)和冷冻(一79V 一196°C)保存三种方法。常温保存技术研究开展的最早，相对比较成熟，但在常温下，一方面微生物生长迅速会影响精液质量，另一方面常温保存时精子活力下降较快。低温保存技术相对冷冻保存而言操作简单方便，成本低，但低温保存技术需要既能提供营养又能保护精子的非渗透性低温保护剂及稀释液。冷冻保存是指将精液经过特殊处理后置于液氮或干冰中，可保存该物种种质资源数年甚至数十年，切实发挥良种公畜的遗传资源。但由于不同公畜精子的生物学特性不同，其冷冻保存效果也存在很大的差别。如牛精液的冷冻保存技术比较成熟，尤其牛精液细管法程序生产已经普及；但羊精子冻后普遍存在情期受胎率不稳定、受胎率低、重复率低等诸多问题；而猪的精子因含脂量较高，脱水比较困难，冷冻-解冻后精子存在超微结构受到损伤(如精子膜、顶体和精子核泡化、损伤或破裂)、在雌性生殖道内寿命缩短和受精率低等问题，因而猪精液冷冻保存还一直处于试验阶段。目前国内外关于驴精液冷冻保存的研究很少，主要原因是一方面是驴的繁殖率低，妊娠期长；第二，由于不同的驴个体间其精液品质有明显的差异，且驴精子本身对低温打击特别敏感，在冷冻解冻过程中极易损伤，因而冷藏和冷冻后的精液极大地降低了受胎率；第三，由于驴发情时间长，人工授精的时机掌握不准确造成其妊娠率低；最后，公驴每次平均射精量多达70ml，密度较稀，且精清中的电解质成分会促进精子早衰。因而，驴的冷冻精液生产操作程度复杂，难度大，严重制约着冷冻精液的应用。驴为马属动物，分布其广，遍及亚、非、拉各大洲。我国的德州驴，体格高大，结构匀称，中外驰名，是改良小型驴种及作为种间 杂交的一个理想品种。因此生产中亟需进行德州驴精液的冷冻保存研究。
技术实现思路
本专利技术提出一种用于驴精液冷冻保存的鸭蛋卵黄抗冻剂，解决了现有技术中母畜繁殖周期长、人工授精受胎率低，驴的冷冻精液生产操作程度复杂，难度大的问题。本专利技术的技术方案是这样实现的一种用于驴精液冷冻保存的鸭蛋卵黄抗冻剂，每IOOmL抗冻剂中包括下列组分Tris 3 4g、葡萄糖I 2. 5g、朽1樣酸1. 5 3. 0g、甘油5 10mL、卵黄10 30mL、青霉素45 55万IU、链霉素4. 5 5. 5万IU、余量为蒸馏水。作为优选的技术方案，一种用于驴精液冷冻保存的鸭蛋卵黄抗冻剂，每IOOmL抗冻剂中包括下列组分Tris 3. 5g、葡萄糖1. 5g、朽1檬酸2. 0g、甘油7mL、卵黄20mL、青霉素50万IU、链霉素5万IU、余量为蒸懼水。本专利技术提出又一种制备用于驴精液冷冻保存的鸭蛋卵黄抗冻剂的方法，包括步骤I)按照每IOOmL抗冻剂中包含Tris 3 4g、葡萄糖I 2. 5g、朽1檬酸1. 5 3. 0g、甘油5 10mL、卵黄10 30mL、青霉素45 55万IU、链霉素4. 5 5. 5万IU、余量为蒸馏水，称取各组分，备用；2)将上述称取的Tris、葡萄糖、柠檬酸用蒸馏水配置成基础液；3)向上述配置成的基`础液中添加步骤I)中称取的青霉素钠和硫酸链霉素配置成I液；4)将所述I液整pH为7.1 7. 8，然后进行过滤灭菌，放入3 5°C冰箱中备用；5)使用前取所述I液，向其中加入步骤I)中称取的卵黄，配置成II液，即得所述用于驴精液冷冻保存的鸭蛋卵黄抗冻剂。作为优选的技术方案，按照每IOOmL抗冻剂中包含Tris 3 4g、葡萄糖I 2. 5g、柠檬酸1. 5 3. 0g、甘油5 10mL、卵黄10 30mL、青霉素45 55万IU、链霉素4. 5 5. 5万IU、余量为蒸懼水,称取各组分,备用。由于采用了上述技术方案，，每IOOmL抗冻剂中包括下列组分Tris 3 4g、葡萄糖I 2. 5g、朽1檬酸1. 5 3. 0g、甘油5 10mL、卵黄10 30mL、青霉素45 55万IU、链霉素4. 5 5. 5万IU、余量为蒸馏水，解决了现有技术中母畜繁殖周期长、人工授精受胎率低，驴的冷冻精液生产操作程度复杂，难度大的问题。具体实验卵黄的取用鸭蛋应来源于无疫病的鸭场，且所使用鸭蛋须新鲜、完整、干净，取用卵黄前先用75%酒精棉球对蛋壳表面进行消毒，待酒精挥发尽后用蛋清分离器取出完整的卵黄；也可在鸭蛋腰中线处敲开一裂纹，将鸭蛋一分两半，利用二个蛋壳交替倾倒的方法，除去蛋清，留下卵黄；然后用灭菌的注射器穿过卵黄膜抽取卵黄。驴冷冻精液抗冻剂的制备方法用电子分析天平准确称取Tris 3. 5g、葡萄糖2g、柠檬酸2. Og将其溶解于50mL蒸馏水中，用磁力搅拌器搅拌均匀后，配置成IOOmL基础液。在基础液中添加5万IU的青霉素钠、硫酸链霉素，配置成I液；用精密pH计调整pH为7. 3,然后用0. 22iim的滤膜进行过滤除菌，放入4°C冰箱中备用。在进行驴精液冷冻前，取360mL I液加入80mL卵黄，用封口膜封好口后，上下颠倒混匀，于4°C冰箱中过夜，分层。第二天，吸去表层杂质，将抗冻剂中层倒入烧杯中，弃去下层沉淀。稀释液经4000rpm/min离心3次,每次30min,去除离心后的稀释液表层杂质及底层沉淀，取中层倒入盐水瓶或蓝口瓶中，加入20mL甘油，用磁力搅拌器充分搅拌均匀后，配置成II液，置于4°C冰箱中待用。I液配好后，可在4°C冰箱中存放约10天。II液现用现配，在4°C冰箱中存放时间不宜超过24h。实验例以德州驴精液冷冻保存进行说明。(一)抗冻剂的配制用电子分析天平准确称取Tris 3. 36g、葡萄糖1. 53g、柠檬酸1. 88g，将其溶解于50mL蒸馏水中，用磁力搅拌器搅拌均匀后，配置成IOOmL基础液。在基础液中添加5万IU的青霉素钠、硫酸链霉素，配置成I液；用精密pH计调整pH为7. 5,然后用0. 22iim的滤膜进行过滤除菌，放入4°C冰箱中备用。在进行驴精液冷冻前，取360mL I液加入80mL卵黄，用封口膜封好口后，上下颠倒混匀，于4°C冰箱中过夜，分层。第二天，吸去表层杂质，将抗冻剂中层倒入烧杯中，弃去下层沉淀。稀释液经4000rpm/min离心3次,每次30min,去除离心后的稀释液表层杂质及底层沉淀，取中层倒入盐水瓶或蓝口瓶中，加入25. 4mL甘油，用磁力搅拌器充分搅拌均匀后，配置成II液，置于4本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于驴精液冷冻保存的鸭蛋卵黄抗冻剂，其特征在于，每100mL抗冻剂中包括下列组分：Tris?3～4g、葡萄糖1～2.5g、柠檬酸1.5～3.0g、甘油5～10mL、卵黄10～30mL、青霉素45～55万IU、链霉素4.5～5.5万IU、余量为蒸馏水。

【技术特征摘要】
1.一种用于驴精液冷冻保存的鸭蛋卵黄抗冻剂，其特征在于，每IOOmL抗冻剂中包括下列组分 Tris 3 4g、葡萄糖I 2. 5g、朽1樣酸1. 5 3. 0g、甘油5 10mL、卵黄10 30mL、青霉素45 55万IU、链霉素4. 5 5. 5万IU、余量为蒸懼水。2.如权利要求1所述的一种用于驴精液冷冻保存的鸭蛋卵黄抗冻剂，其特征在于，每IOOmL抗冻剂中包括下列组分 Tris 3. 5g、葡萄糖1. 5g、朽1檬酸2. 0g、甘油7mL、卵黄20mL、青霉素50万IU、链霉素5万IU、余量为蒸懼水。3.一种制备如权利要求1所述的用于驴精液冷冻保存的鸭蛋卵黄抗冻剂的方法，其特征在于，包括步骤 1)按照每IOOmL抗冻剂中包含Tris3 4g、葡萄糖I 2. 5g、朽1檬酸1. 5 3. 0g、甘油5 10mL、卵黄10 30...

【专利技术属性】
技术研发人员：王长法，张燕，王玲玲，朱涛涛，张瑞涛，鞠志花，黄金明，高运东，仲跻峰，侯明海，王银朝，闫金华，
申请(专利权)人：山东天龙牧业科技有限公司，山东省农业科学院奶牛研究中心，
类型：发明
国别省市：