本发明专利技术涉及一种基于石墨烯-纳米贵金属复合材料的电化学DNA生物传感器及其制备方法，该方法包括：（1）用Hummer法从石墨粉制备氧化石墨烯水分散液。（2）化学还原法制备纳米贵金属粒子/石墨烯复合材料。(3)将贵金属/石墨烯复合材料黏附到玻碳电极上，用单链DNA修饰，修饰电极和目的基因杂交，制备得到电化学DNA传感器。该传感器能大幅提高DNA的检出限至1.2*10-10mol/L。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种电化学DNA生物传感器及其所用电极材料的制备方法，属于电化学和材料合成
技术介绍
生物传感器是目前发展最为迅速并被认为最有产业化前景的一种检测器件。它具有高专一性、短时低费用分析、对分析物质没有特殊的要求、操作安全、便于现场测定等优点。从1962年Clark和Lyons最先提出生物传感器的设想至今，其在近几十年获得蓬勃而迅速的发展。在国民经济的各个部门如食品、制药、化工、临床检验、生物医学、环境监测等方面得到广泛应用。随着分子生物学研究的深入，对脱氧核糖核酸DNA的检测手段变得越来越重要。传统的凝胶电泳法需要经过放射性标记、聚合酶链式反应(PCR)、电泳等一系列操作过程，消耗时间长，劳动强度大。在这种情况下，以Watson-Crick碱基配对为基础的DNA传感器应运而生。DNA传感器以DNA为敏感元件，DNA固定在用作换能器的电极上，并通过电极将DNA与DNA、核糖核酸(ribonucleic acid,RNA)、药物、化合物、自由基等相互作用的生物学信号转变成可检测的光、电、声波等物理信号。用DNA传感器不仅省去了放射性标记的危险性，而且扣除了电泳操作的长时间浪费，因此近几年来受到了全世界科技工作者的广泛重视。除了 DNA检测外，DNA传感器还在环境监测、药物研究、法医鉴定及食品检验等多方面显示了诱人的应用前景。在电化学DNA传感器领域，电极材料对于电化学生物传感器的性能表现至关重要。目前电化学DNA传感器使用的主要是负载纳米贵金属的玻碳电极。诚然，纳米贵金属具有较高的电催化性能，但是纳米材料的最大的缺点是因为颗粒较小，不能在电极上像微米级材料那样紧密堆积，导致电流密度较少，因此传感器的灵敏度和特异性较差。石墨烯(Graphene),是一种由碳原子以Sp2杂化轨道组成的六角型呈蜂巢晶格、只有一个碳原子厚度的二维材料。石墨烯特殊的结构使得石墨烯具有一系列优良的性质，它的理论比表面积高达2600m2/g，具有突出的导热性能和力学性能以及室温下高速的电子迁移率。石墨烯还具有完美的量子隧道效应、半整数的量子霍尔效应等一系列性质。石墨烯这些独特的力学、电学、电化学以及场发射性能，使得它在导电材料、催化材料、储能材料和纳米电子元器件中具有重要的潜在应用价值。基于化学还原氧化石墨烯的DNA传感器，不仅能同时检测GATC四种碱基对(石墨电极和玻碳电极都不能),而且还能从单链(ssDNA)或双链DNA中分离出四组碱基对；石墨烯修饰免疫电极发现可以用于检测卵巢癌SK0V-3细胞。鉴于石墨烯作电极材料用于生物传感器的优异特性，本专利技术将石墨烯-贵金属复合材料引入DNA传感器领域，大大提高DNA传感器的特异性和灵敏度，以此复合材料构建的DNA生物传感器，实现对目的基因，例如转基因食品中花椰菜花叶病毒35s启动子等的检测。
技术实现思路
本专利技术目的在于克服纳米贵金属直接用作DNA传感器电极材料时电流密度小的缺陷，制备具有高灵敏度和高选择性的电化学DNA传感器。本专利技术提供了一种高负载量纳米贵金属/石墨烯复合材料及其制备方法，其具体的特征为3. 5nm贵金属粒子负载于约2-5 μ m的单层石墨烯上，构成贵金属/石墨烯复合材料；然后黏附于玻碳电极上制备成修饰电极；将花椰菜花叶病毒35s启动子5’ GCTCCTACAAATGCCATCA3’固载到电极上，然后与目的基因杂交制备成电化学DNA生物传感器，实现对转基因食品的检测。一种基于石墨烯-纳米贵金属复合材料的电化学DNA生物传感器，包括电极和固载于电极上的单链DNA，所述电极上黏附有复合材料层，复合材料层为3. 5nm贵金属粒子负载于2-5 μ m的单层石墨烯上构成。本专利技术所述电化学DNA生物传感器的制备步骤如下( I)氧化石墨烯的制备利用Hummer法制备氧化石墨烯室温下，在浓硫酸中搅拌石墨，并且加入硝酸钠，一段时间后，加入高锰酸钾，搅拌，绿色的悬浮液冷却至室温，继续搅拌，然后将冰水倒入溶液中，最后加入过量的过氧化氢(3%)并且将混合液搅拌整晚，过滤，透析袋透析，超声，最后得到氧化石墨烯。(2)贵金属/氧化石墨烯材料的制备与表征将一定量的贵金属前驱体溶液(氯钼酸钾、氯金酸、氯钯酸等)加入氧化石墨烯溶液中，加入还原剂，控制反应条件，例如温度、微波、超声等，制备高负载量、高分散度M/G0(M=Au, Pt, Pd)。(3)电极的修饰将M/G0材料黏附在玻碳电极表面，然后将单链DNA溶液I滴加到电极表面，室温下自然晾干，然后Tris-HCl缓冲溶液反复清洗电极。(4)电化学DNA生物传感器的制备将单链DNA修饰电极浸入含目的基因的杂交液中，置于恒温培养箱杂交反应后，取出电极，清洗，杂交前后的电极作工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，钼丝为辅助电极，置于含[Co (phen)3]3+的Tris-HCl和NaCl缓冲液中浸泡并加一定的电压，用双蒸水冲洗电极，然后将电极浸入Tris-HCl和NaCl缓冲液中进行方波伏安法检测，记录杂交前后[Co (phen)3]3+的还原峰电流值，根据电流值的变化测定DNA含量。步骤(2)所述的贵金属前驱体是指含钼、钯或金的化合物。如氯钯酸钾、氯钼酸或氯金酸等。步骤(2)所述的还原剂是指硼氢化钠、L-抗坏血酸酯或柠檬酸。步骤(2)的反应温度为10_90°C。步骤(3)所述的单链DNA包括花椰菜花叶病毒35s启动子或NOS终止子的特异性单链DNA。具体实施例方式实施例(一)在500mL容器中依次加入25g的浓硫酸、2. 4g过硫酸钾、2. 5g五氧化二磷，搅拌，在水浴下慢慢升温至80°C，加入5. Og石墨，搅拌10小时，自然冷却至常温，抽滤后，干燥，得到预氧化石墨。在烧瓶中加入2. 5g预氧化石墨、1. 3g亚硝酸钠、105g浓硫酸，冰浴下搅拌，缓慢加入7. 5g高锰酸钾，控制温度在0-5°C反应I个小时，然后改用35°C水浴加热，保温反应8小时，撤去水浴并用滴管滴加蒸馏水(T〈98°C )，水浴加热升温至96°C，保温反应30分钟，在温度降为50-60°C时向瓶中加入7. 4g5%盐酸和5mL30%双氧水，用蒸馏水洗涤至中性，超声剥离、透析，干燥，得到氧化石墨烯。称取20mg氧化石墨烯于20mL水中，然后加入氯钮酸钾8mg,超声分散30min,升温至20°C，然后缓慢滴加L-抗坏血酸酯溶液，反应Ia后，离心，乙醇洗涤，干燥，得到Pd/G复合材料，经透射电子显微镜观察(TEM)发现，Pd粒子大小为3. 5nm，石墨烯大小为3μπι.将Pd/G材料黏附在玻碳电极表面，然后将单链花椰菜花叶病毒35s启动子溶液I滴加到电极表面，室温下自然晾干，然后Tris-HCl缓冲溶液反复清洗电极。将单链DNA修饰电极浸入目的基因的杂交液中，置于恒温培养箱杂交反应后，取出电极，清洗，杂交前后的电极作工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，钼丝为辅助电极，置于含O.1mmol/L[Co (phen)3]3+ 的 5mmol/LTris-HCl 和 5mmol/L NaCl 缓冲液(pH=7. 5)中浸泡并加 O. 5V电压，用双蒸水冲洗电极，除掉未结合的[Co (phen)3]3+,然后将电极浸入5mmol/LTris_HCl和5mmol/L NaCl缓本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种基于石墨烯?纳米贵金属复合材料的电化学DNA生物传感器的制备方法，其特征在于步骤如下：（1）制备氧化石墨烯：用Hummer法从石墨粉制备氧化石墨烯水分散液；（2）制备纳米贵金属/石墨烯复合材料：将一定量的贵金属前驱体溶液加入氧化石墨烯溶液中，加入还原剂，一定温度下水热反应制备高负载量、高分散度纳米复合材料；（3）制备单链DNA修饰电极：将纳米贵金属材料黏附在玻碳电极表面，然后用单链DNA修饰；（4）电化学DNA生物传感器的制备：将单链DNA修饰电极浸入含目的基因的杂交液中，杂交后取出电极，清洗。
【技术特征摘要】
1.一种基于石墨烯-纳米贵金属复合材料的电化学DNA生物传感器的制备方法，其特征在于步骤如下Cl)制备氧化石墨烯用Hummer法从石墨粉制备氧化石墨烯水分散液；(2)制备纳米贵金属/石墨烯复合材料将一定量的贵金属前驱体溶液加入氧化石墨烯溶液中，加入还原剂，一定温度下水热反应制备高负载量、高分散度纳米复合材料；(3)制备单链DNA修饰电极将纳米贵金属材料黏附在玻碳电极表面，然后用单链DNA修饰；(4)电化学DNA生物传感器的制备将单链DNA修饰电极浸入含目的基因的杂交液中，杂交后取出电极，清洗。2.根据权利要求1所述基于石墨烯-纳米贵金属复合材料的电化学DNA生物传感器的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述的贵金属前驱体是指含钼、钯或金的化合物。3.根据权利要求2所述基于石墨烯-纳米贵金属复合材料的电化学DNA生物传感器的制备方法，其特征在于，所述...
【专利技术属性】
技术研发人员：秦勇，储富强，陶永新，孔泳，黎珊，
申请(专利权)人：常州大学，
类型：发明
国别省市：
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