在植物中表达蛋白质本发明专利技术涉及在植物中生产流感病毒H5多肽的方法，所述方法包括下列步骤：将流感H5基因或编码其功能等价物的核酸克隆到适于靶向植物中存在的组分的载体中，用所述载体侵入植物的至少一部分，或者用所述载体转化植物组织，以瞬时表达所述流感病毒H5多肽和/或产生转基因植物；和回收由所述植物表达的流感病毒H5多肽。本发明专利技术还涉及在所述方法中使用的或者作为所述方法的结果产生的载体、转基因植物或其部分和这样的植物的子代。
【技术实现步骤摘要】
在植物中表达蛋白质本专利技术是国际申请号PCT/ZA2006/000063，国际申请日为2006年5月2日，进入中国国家阶段日期为2007年10月26日，中国国家申请号为200680014202. 5，专利技术名称为“在植物中表达蛋白质”的分案申请。
技术介绍
本专利技术涉及在植物中表达蛋白。特别地，本专利技术涉及转基因蛋白表达和高产量蛋白生产的细胞内定位的方法。本专利技术还涉及在植物中生产人乳头瘤病毒(HPV)蛋白和/或流感病毒H5蛋白。本专利技术还涉及评估蛋白在植物内表达的快速机制。应用转基因植物进行异源蛋白的大规模生产正逐渐获得广泛的接受，并且可能成为疫苗蛋白节约成本生产的平台。产生转基因植物研究一大类蛋白和/或表达载体的表达特征并不总是可行的，原因在于这一程序费时的本质。相反，瞬时表达系统能够快速评估各种不同的蛋白在各种植物物种中的蛋白表达。关于应用转基因植物进行大规模蛋白生产的另一个问题通常是生产的异源蛋白的令人失望的低水平。植物质体，特别是叶绿体，已经成功地被表达异源蛋白的重组载体转化，以显著地增加植物中由每份总可溶蛋白所产生的蛋白水平(参见，例如，W02005/011367和W02004/005467A2)。质体还能够输入各种分子，包括蛋白。存在不同的方法，通过这些方法发生分子输入，一个这样的方法涉及与质体的类囊体膜相互作用。异源蛋白靶向质体是一种显著增加蛋白在植物细胞内的积聚的机制。许多年来一直应用农杆菌(Agrobacterium)介导的基因转移来产生稳定的转化植物。这种方法包括将T-复合物(一种由农杆菌T-DNA和毒力基因产物形成的复合物)从农杆菌菌株转移到植物细胞(Zupan等.，2000)。将位于限定单链T-DNA的25bp同向重复序列(左和右边界)之间的任何DNA转运到植物细胞核中(Zupan等.，2000)，在这里它通过不正常重组而整合到植物染色体上(Somers和Makarevitch, 2004)。在所述核内存在的许多T-DNA拷贝没有结合，但是得到转录，这引起瞬时表达。瞬时表达不受位置效应的影响，并且可以产生比稳定转化显著更高的外源蛋白水平(Kapila等.，1997)。通常应用两种农杆菌侵入(农杆菌侵入法)方法注射和真空侵入。农杆菌注射包括直接注射到叶片的远轴气室，而叶片仍然附着在植物上(Voinnet等.，2003)。在真空侵入过程中，对农杆菌混悬液应用真空，叶片浸没在所述混悬液中(Kapila等.，1997)。尽管通常只在少数叶片上进行，但是这一技术可以规模化Medicago Inc. (Quebec, Canada)的研究者每周能够进行农杆菌侵入多达7500片苜蓿叶片，并且Stefan Schillberg及同事(Institute for Molecular Biotechnology,RffTH Aachen,Germany)已经进行了农杆菌侵入了多达100kg的烟草叶片(Twyman 2004)。农杆菌介导的瞬时表达在侵入后60到72小时达到最大,然后由于转录后基因沉默(PTGS)而迅速下降(Voinnet等.，2003)。PTGS或RNA干扰是一种适应性抗病毒抵御反应，其限制病毒在植物中 的复制和传播。这一过程包括在胞质中识别靶点RNA和起始序列-特异性RNA降解途径(Voinnet，2001)。某些植物病毒编码具有抑制PTGS能力的沉默阻抑制子。这些沉默抑制蛋白中的一些，诸如番茄斑萎病毒(TSWV)的NSs (Takeda等，2002)，和番爺丛矮病毒的pl9 (Voinnet等.，2003)已经用来延长和扩增农杆菌介导的瞬时表达，其通过包含沉默抑制基因的农杆菌的共同侵入而进行。对于将商购蛋白在植物中的表达优化以达到使植物成为可行平台的水平存在需求。具体地，存在对于在植物中生产HPV蛋白和/或流感病毒H5蛋白的方法的需求。还存在对载体、转基因植物或其部分和这样的植物的子代的需求以实现如前文所述的需要。专利技术概述按照本专利技术的第一方面，提供一种在植物中生产HPV多肽和/或流感病毒H5多肽的方法，其包括步骤1.将HPV基因和/或流感病毒H5基因或编码它们的功能等价物的核酸克隆到适于靶向植物中存在的成分的载体中；2.用所述载体侵入至少植物的部分，或者用所述载体转化植物组织，以瞬时表达HPV多肽和/或流感病毒H5多肽，和/或产生转基因植物；和3.回收由植 物表达的HPV多肽和/或流感病毒H5多肽。术语‘植物’意欲包括缺少专门的感觉器官和自主运动能力的所有生命有机体。同样地，所述定义包括单子叶植物和双子叶植物以及所有的光合生物。术语‘HPV多肽’意欲包括HPV LI蛋白；与另一 HPV抗原肽融合的嵌合HPV LI肽；与衍生于任何抗原表位、B细胞或T细胞特异性的异源肽融合的嵌合HPV LI肽以及HPVL2蛋白或它们的功能等价物。已作必要的修正，同样的意思适用于术语‘HPV基因’。术语‘植物成分’意欲包括质体、内质网、细胞质和质外体。优选地所述植物成分是质体。靶向意指载体中可以包含靶向序列。这样的靶向序列可被翻译成肽，所述肽将载体或其产物导向植物中需要的成分，诸如质体。按照本专利技术的载体优选地包括可操作性地连接到编码序列上的启动子和其它必需调节子，诸如终止子等。应该理解用载体侵入植物的至少一部分可以引起蛋白的瞬时表达，并且用载体转化植物组织以产生转基因植物可以引起蛋白的转基因表达，意欲这两种形式的表达都属于本申请的范围。在本说明书中，提及蛋白、肽或基因或它们的功能等价物包括提及其变体，所述变体能够很大程度上行使与蛋白、肽、多肽或基因相同的功能。优选地，本专利技术涉及HPV-16L1蛋白的生产；与另一 HPV抗原肽融合的嵌合HPV LI肽；与衍生于任何抗原表位、B细胞或T细胞特异性的异源肽融合的嵌合HPV LI肽；HPV L2蛋白；或流感病毒H5蛋白。优选地，所述载体是二元载体，更优选地为根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens) 二兀载体。所述载体可以适于靶向质体，其通过使得所表达的多肽包括能够与质体的类囊体膜特别是类囊体膜的转运结构相互作用的部分而进行。这一相互作用可以使得多肽从其所表达的细胞质输入到质体中。输入到细胞质的机制对于蛋白的正确折叠可能是重要的。然而，应该理解所述载体可以适于靶向要转化的质体本身，并且多肽的表达可以完全在质体内发生。不希望受到理论局限，本申请人认为进入到质体的多肽以其一级结构进入，并且在质体内进行折叠成其二级和三级结构，即，远离细胞的细胞质。同样地，本申请人认为通过载体表达多肽可以发生在质体内，然后在其中它采用其二级和三级结构是专利技术原理的合理外延。换句话说，本申请人认为专利技术原理延伸到质体的转化。在这样的条件下，蛋白的表达完全发生在质体内，并且不与细胞的细胞质接触。优选地，所述HPV LI基因；与另一 HPV抗原基因融合的嵌合的HPVLl基因；与衍生于任何抗原表位、B细胞或T细胞特异性的异源基因融合的嵌合HPV LI基因；HPV L2基因；或流感病毒H5基因是优化的基因，例如，人密码子优化的，BCG密码子优化的或植物密码子优化的。HPV LI基因或HPV LI嵌合体的基因还可以以另一种方式修饰，例如，核定位信号缺失。按照本专利技术的方法还可以本文档来自技高网...
【技术保护点】
在植物中生产流感病毒H5多肽的方法，所述方法包括下列步骤：i)将流感病毒H5基因或编码其功能等价物的核酸克隆到适于靶向植物中存在的组分的载体中，其中所述植物组分选自由内质网和质外体组成的组；ii)用所述载体侵入所述植物的至少一部分，或者用所述载体转化植物组织，从而瞬时表达所述流感病毒H5多肽，和/或产生转基因植物；和iii)回收由所述植物表达的流感病毒H5多肽。
【技术特征摘要】
2005.04.29 ZA 2005/034541.在植物中生产流感病毒H5多肽的方法，所述方法包括下列步骤 i)将流感病毒H5基因或编码其功能等价物的核酸克隆到适于靶向植物中存在的组分的载体中，其中所述植物组分选自由内质网和质外体组成的组； )用所述载体侵入所述植物的至少一部分，或者用所述载体转化植物组织，从而瞬时表达所述流感病毒H5多肽，和/或产生转基因植物；和 iii)回收由所述植物表达的流感病毒H5多肽。2.权利要求1的方法，其中一个或多个靶向序列包含于所述载体中，所述靶向序列编码将所述流感病毒H5多肽从细胞质导向所述植物组分的多肽。3.权利要求1或权利要求2的方法，其中所述载体包括可操作地与所述载体的编码序列连接的启动子和其它调节子等。4.前述权利要求任一项的方法，其中所述载体是二元载体，优选根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens) 二兀载体。5.前述权利要求任一项的方法，其中所述流感病毒H5基因是密码子使用优化的基因，优选人密码子使用优化的基因、BCG密码子使用优化的基因或植物密码子使用优化的基因。6.前述权利要求任一项的方法，其还包括用在植物中适于抑制转录后基因沉默的抑制蛋白共同侵入所述植物的步骤，所述抑制蛋白如番茄斑萎病毒的NSs蛋白或番茄丛矮病毒的 P19。7.前述权利要求任一项的方法，其中所述侵入通过直接注射或通过真空进行。8.前述...
【专利技术属性】
技术研发人员：安娜莉泽·威廉森，爱德华·彼德·雷比茨基，詹姆斯·马尔科姆·麦克莱恩，因加·伊莎贝尔·贝克尔希策尔奥特，
申请(专利权)人：开普敦大学，
类型：发明
国别省市：
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