【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
技术介绍
1、由于植物中复杂糖蛋白(特别是病毒糖蛋白)沿分泌途径的低表达产量、非天然糖基化和低效成熟(折叠)，给这些蛋白的产生提出了挑战。其分子基础尚不清楚，这严重阻碍了分子农业作为一种可行的药物生产系统的广泛实施。相反，该技术大多局限于主流行业无法满足市场需求的小众应用。我们之前的工作和本文描述的工作表明，这是由于宿主细胞机制的差异造成的，这些差异不支持有效的糖基化、分子伴侣介导的折叠和蛋白水解加工，最终阻碍了这些蛋白的折叠。这限制了系统中复杂糖基化蛋白的产生，并且阻碍了使用植物从复杂的高度糖基化病毒蛋白稳定地产生疫苗。这同样阻碍了对其他基于复杂糖蛋白的药物的产生。
2、植物中复杂糖蛋白的产生通常导致低产量、低效加工(成熟/折叠)和与天然蛋白的结构和糖基化不完全相似的植物特异性糖基化。植物糖基化机制对人药物的开发提出了一些挑战，如低效糖基化可能导致聚糖占有率低，潜在的免疫原性植物特异性修饰和其他非天然聚糖加工导致在哺乳动物糖蛋白中不存在的糖型。然而，以前并没有在高度糖基化的病毒糖蛋白中描述过这些糖型的流行，而且对植物产生的糖蛋白通常也缺乏足够的定量分析。因此，植物糖基化机制如何影响复杂病毒糖蛋白或其他类似复杂糖基化蛋白的产生尚不清楚。专利技术人描述了它们的流行情况，并且强调植物中低效的糖基化损害了蛋白折叠。专利技术人进一步解决了这些限制因素，通过将各种糖工程策略与分子伴侣共表达整合，使得能够产生重组hiv env gp140三聚体，其与等效的哺乳动物细胞产生的蛋白非常相似。随后，他们将这些方法应用于在植物中从原型
3、很少有植物产生的糖蛋白进入临床测试。medicago inc.，可以说是分子农业中的全球领导者，尚未解决天然产生和植物产生的蛋白之间在糖基化方面的根本差异，这可能阻碍了许多复杂蛋白以其天然状态产生。他们的技术平台已成功开发出流感和sars-cov-2vlp疫苗，并已在临床试验中进行了测试。然而，这些抗原并不能完全再现天然糖蛋白的结构，他们的技术平台也没有完全解决产生其他复杂糖蛋白所必需的关键宿主限制。他们的疫苗还含有植物特异性聚糖，目前尚不清楚它们是否糖基化良好。他们的平台需要将所关注的蛋白与流感的跨膜和细胞质尾部融合以稳定三聚体并产生vlp。虽然这对sars-cov-2非常有效，但是它可能会损害其他病毒抗原的天然结构，而这对于适当的免疫原性可能非常重要。我们的工作提供了一种在植物中产生复杂病毒(和其他)糖蛋白的整合方法，这些糖蛋白可以再现其糖基化的重要结构特征和关键元素，这正是适当的免疫原性所必需的。这项工作还为生产具有定制糖基化的糖蛋白以提高治疗剂的效价和疫苗的效力奠定了基础。这同样适用于其他具有治疗剂价值的病毒糖蛋白，例如抗体。
技术实现思路
1、本专利技术涉及用于在植物细胞中所关注的异源多肽的增加表达、提高糖基化效率、减少植物特异性修饰、减少聚集和/或促进其正确折叠和寡聚体组装的方法。优选地，所述异源多肽是复杂糖蛋白。所述方法包括以下步骤：将所关注的异源多肽与(i)编码哺乳动物分子伴侣蛋白的多肽，(ii)提高所关注的异源多肽中n-聚糖占有率的多肽，以及(iii)干扰植物细胞中负责截短聚糖形成的酶并减少截短聚糖形成的核酸共表达。本专利技术还涉及植物细胞和植物，其瞬时或稳定地共表达所关注的异源多肽、哺乳动物分子伴侣蛋白、提高聚糖占有率的多肽和核酸。
2、在本专利技术的第一方面，提供一种在植物细胞中产生所关注的异源多肽的方法。应当理解，所关注的异源多肽可以是糖蛋白，所述糖蛋白优选用于药物应用、疫苗、诊断、治疗和/或研究试剂。还应当理解，所关注的多肽可以用于人或动物。所述方法包括或由以下组成：首先提供编码哺乳动物分子伴侣蛋白的第一核酸，提供编码增加聚糖占有率的多肽的第二核酸，特别是其中第二多肽增加糖基化效率，更特别是n-糖基化效率，提供干扰植物细胞中负责截短聚糖形成的酶的第三核酸，以及提供编码所关注的异源多肽的第四核酸。第二，将第一核酸、第二核酸、第三核酸和第四核酸克隆到至少一个表达载体中，所述表达载体适合在植物细胞中表达多肽，并且用步骤中的至少一个表达载体转化或浸润植物细胞。第三，在植物细胞中共表达编码哺乳动物分子伴侣蛋白的多肽、增加聚糖占有率的多肽、干扰负责截短聚糖形成的酶的核酸和所关注的异源多肽，最终从植物细胞回收所关注的异源多肽。
3、在本专利技术的一个实施方案中，所述方法导致以下中的至少一种或多种：(i)所关注的异源多肽的表达增加；(ii)所关注的异源多肽的糖基化效率增加；(iii)所关注的异源多肽的植物特异性修饰减少；(iv)所关注的异源多肽的聚集减少；(v)所关注的异源多肽的折叠效率增加；和/或(vi)所关注的异源多肽的寡聚化提高。
4、在本专利技术的第二个实施方案中，分子伴侣蛋白是哺乳动物分子伴侣蛋白，所述哺乳动物分子伴侣蛋白优选是选自钙联接蛋白、钙网蛋白、grp78/bip、grp94、grp170、hsp47、erp29、蛋白二硫键异构酶、肽基脯氨酰基顺反异构酶和erp57的至少一种人分子伴侣蛋白。更优选地，人分子伴侣蛋白选自钙联接蛋白和/或钙网蛋白。
5、在本专利技术的第三个实施方案中，增加聚糖占有率的多肽是寡糖基转移酶。优选地，寡糖基转移酶是来自硕大利什曼原虫(leishmania major)的lmstt3d。尽管本领域技术人员会理解，任何增加所关注的异源多肽中聚糖占有率的蛋白都会导致所关注的异源多肽更有效的糖基化。
6、在本专利技术的第四个实施方案中，提供第三核酸，其是编码rnai剂(agent)的rnai表达盒，所述rnai剂干扰负责产生细胞中产生的寡甘露糖苷(paucimannosidic)/截短聚糖的蛋白。优选地，rnai剂干扰表达自氨基己糖苷酶3基因的蛋白。甚至更优选地，rnai剂减少细胞中氨基己糖苷酶3蛋白的表达，从而减少细胞中产生的寡甘露糖苷/截短聚糖的量。
7、在本专利技术的第五个实施方案中，植物细胞是本氏烟草(nicotiana benthamiana)细胞。优选地，本氏烟草(n.benthamiana)是缺少植物特异性n-聚糖残基的糖基化突变体。
8、在本专利技术的第六个实施方案中，所关注的异源多肽是糖蛋白。优选地，所述糖蛋白是病毒糖蛋白，用于药物应用、疫苗、诊断、治疗和/或研究试剂。
9、在本专利技术的另一个实施方案中，至少一个表达载体包含启动子和/或其他调节子，可操作地连接至第一核酸、第二核酸、第三核酸和第四核酸。应当理解，第一核酸、第二核酸、第三核酸和第四核酸可以包本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种在植物细胞中产生所关注的异源多肽的方法，所述方法包括：
2.权利要求1的方法，其中所述方法导致以下中的至少一种或多种：
3.权利要求1或2的方法，其中所述哺乳动物分子伴侣蛋白是选自钙联接蛋白、钙网蛋白、GRP78/BiP、GRP94、GRP170、HSP47、ERp29、蛋白二硫键异构酶、肽基脯氨酰基顺反异构酶和ERp57的至少一种人分子伴侣蛋白。
4.权利要求3的方法，其中所述人分子伴侣蛋白选自钙联接蛋白和/或钙网蛋白。
5.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述增加聚糖占有率的多肽是寡糖基转移酶。
6.权利要求5的方法，其中所述寡糖基转移酶是来自硕大利什曼原虫(Leishmaniamajor)的LmSTT3D。
7.权利要求1-6中任一项的方法，其中所述第三核酸是编码干扰氨基己糖苷酶3基因的RNAi剂的RNAi表达盒。
8.权利要求7的方法，其中所述RNAi剂减少氨基己糖苷酶3蛋白在细胞中的表达，从而减少细胞中产生的截短聚糖的量。
9.权利要求1-8中任一项的方法，其中所述
10.权利要求9的方法，其中所述本氏烟草(N.benthamiana)细胞是缺少植物特异性N-聚糖残基的糖基化突变体。
11.权利要求1-10中任一项的方法，其中所关注的异源多肽是糖蛋白。
12.权利要求11的方法，其中所述糖蛋白是病毒糖蛋白。
13.权利要求1-12中任一项的方法，其中所述至少一个表达载体包含启动子和/或其他调节子，可操作地连接至第一核酸、第二核酸、第三核酸和第四核酸。
14.一种植物细胞，其用至少一个表达载体转化，所述表达载体包含：
15.权利要求14的植物细胞，其中所述哺乳动物分子伴侣蛋白是选自钙联接蛋白、钙网蛋白、GRP78/BiP、GRP94、GRP170、HSP47、ERp29、蛋白二硫键异构酶、肽基脯氨酰基顺反异构酶和ERp57的至少一种人分子伴侣蛋白。
16.权利要求15的植物细胞，其中所述人分子伴侣蛋白选自钙联接蛋白和/或钙网蛋白。
17.权利要求14-16中任一项的植物细胞，其中所述增加聚糖占有率的多肽是寡糖基转移酶。
18.权利要求17的植物细胞，其中所述寡糖基转移酶是来自硕大利什曼原虫(Leishmania major)的LmSTT3D。
19.权利要求14-18中任一项的植物细胞，其中所述第三核酸是编码干扰氨基己糖苷酶3基因的RNAi剂的RNAi表达盒。
20.权利要求19的植物细胞，其中所述RNAi剂减少氨基己糖苷酶3蛋白在细胞中的表达，从而减少细胞中产生的截短聚糖的量。
21.权利要求14-20中任一项的植物细胞，其中所关注的异源多肽是糖蛋白。
22.权利要求21的植物细胞，其中所述糖蛋白是病毒糖蛋白。
23.权利要求14-22中任一项的植物细胞，其中所述至少一个表达载体包含启动子和/或其他调节子，可操作地连接至第一核酸、第二核酸、第三核酸和第四核酸。
24.权利要求14-23中任一项的植物细胞，其中所述植物细胞来自单子叶植物或双子叶植物。
25.权利要求24的植物细胞，其中所述植物细胞来自选自玉米、水稻、高粱、小麦、木薯、大麦、燕麦、黑麦、甘薯、大豆、苜蓿、烟草、向日葵、棉花和油菜的植物。
26.权利要求25的植物细胞，其中所述植物细胞来自烟草植物。
27.权利要求26的植物细胞，其中所述烟草植物是本氏烟草。
28.权利要求27的植物细胞，其中所述本氏烟草是缺少植物特异性N-聚糖残基的糖基化突变体。
29.一种植物，其包含权利要求14-28中任一项的植物细胞。
...【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种在植物细胞中产生所关注的异源多肽的方法，所述方法包括：
2.权利要求1的方法，其中所述方法导致以下中的至少一种或多种：
3.权利要求1或2的方法，其中所述哺乳动物分子伴侣蛋白是选自钙联接蛋白、钙网蛋白、grp78/bip、grp94、grp170、hsp47、erp29、蛋白二硫键异构酶、肽基脯氨酰基顺反异构酶和erp57的至少一种人分子伴侣蛋白。
4.权利要求3的方法，其中所述人分子伴侣蛋白选自钙联接蛋白和/或钙网蛋白。
5.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述增加聚糖占有率的多肽是寡糖基转移酶。
6.权利要求5的方法，其中所述寡糖基转移酶是来自硕大利什曼原虫(leishmaniamajor)的lmstt3d。
7.权利要求1-6中任一项的方法，其中所述第三核酸是编码干扰氨基己糖苷酶3基因的rnai剂的rnai表达盒。
8.权利要求7的方法，其中所述rnai剂减少氨基己糖苷酶3蛋白在细胞中的表达，从而减少细胞中产生的截短聚糖的量。
9.权利要求1-8中任一项的方法，其中所述植物细胞是本氏烟草(nicotianabenthamiana)细胞。
10.权利要求9的方法，其中所述本氏烟草(n.benthamiana)细胞是缺少植物特异性n-聚糖残基的糖基化突变体。
11.权利要求1-10中任一项的方法，其中所关注的异源多肽是糖蛋白。
12.权利要求11的方法，其中所述糖蛋白是病毒糖蛋白。
13.权利要求1-12中任一项的方法，其中所述至少一个表达载体包含启动子和/或其他调节子，可操作地连接至第一核酸、第二核酸、第三核酸和第四核酸。
14.一种植物细胞，其用至少一个表达载体转化，所述表达载体包含：
15.权利要求14的植物细胞，其中所述哺乳动物分子伴侣蛋白是选自钙联接蛋白、钙网...
【专利技术属性】
技术研发人员：E·P·雷比茨基，E·A·马戈林，R·施特拉塞尔，
申请(专利权)人：开普敦大学，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。