本发明专利技术公开了一种表达传染性法氏囊病病毒多聚蛋白基因VP243的DNA疫苗及其构建方法和应用。本发明专利技术将传染性法氏囊病病毒强毒株(HLJ0504)的多聚蛋白基因(VP243)进行鸡偏嗜密码子优化，并克隆入真核表达载体pCAGGS，构建了重组表达质粒pCAGoptiVP243。将制备的pCAGoptiVP243以100μg的剂量经腿肌两点注射首免14日龄SPF鸡，28日龄以相同剂量和途径二免，二免后14天攻击IBDV强毒HLJ0504株。结果表明，该DNA疫苗可以诱导较高水平的抗体并能提供对强毒的免疫保护。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种DNA疫苗及其构建方法和应用，特别涉及一种表达传染性法氏囊病病毒多聚蛋白基因VP243的DNA疫苗及其构建方法和应用。本专利技术属于生物医药领域。
技术介绍
传染性法氏囊病病毒(Infectious Bursal Disease Virus, IBDV)主要侵害雏鸡法氏囊等中枢免疫器官，导致以淋巴细胞衰竭为特征的免疫抑制性疾病。IBDV是双链、双节段RNA病毒，属于双RNA病毒科禽双RNA病毒属，其基因组由A、B两个节段组成，B节段(约2. 8kb)编码VPl蛋白，为RNA依赖的RNA聚合酶。A节段(约3. 3kb)具有两个相互部分重叠的开放阅读框(ORF)，ORFl编码分子量约为IlOkDa的前体融合蛋白(VP243)，前体融合蛋白经过加工，成熟后变为VP2、VP3和VP4。0RF2编码VP5蛋白，也称非结构蛋白。目前，预防IBD主要使用弱毒苗和灭活苗，随着IBDV变异株和超强毒株的出现，经常导致免疫失败。重组亚单位疫苗和活载体疫苗表达的VP2蛋白虽然能在不同程度上诱导中和抗体，但仍未能解决IBDV抗原变异问题。DNA疫苗的出现，开拓了 IBD疫苗研究的新纪元。DNA疫苗能同时诱导体液免疫和细胞免疫，对不同血清亚型毒株具有交叉保护，还具有嵌合免疫、多重免疫及联合免疫等优点。本研究首次将IBDV多聚蛋白基因VP243进行了密码子优化，克隆入真核表达载体pCAGGS中，构建了 IBDV DNA疫苗pCAGoptiVP243，并对其免疫原性进行了研究。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种表达传染性法氏囊病病毒多聚蛋白基因VP243的DNA疫苗及其构建方法和应用。为了达到以上目的，本专利技术采用的技术手段为 本专利技术的一种表达传染性法氏囊病病毒多聚蛋白基因VP243的DNA疫苗，其特征在于所述的DNA疫苗中含有SEQ ID NO. I所示的序列。在本专利技术中，优选的，所述的DNA疫苗是通过将SEQ ID NO. I所示的序列克隆入pCAGGS表达载体中得到的。进一步的，本专利技术还提供了一种表达传染性法氏囊病病毒多聚蛋白基因VP243的DNA疫苗的构建方法，其特征在于包括以下步骤(I)根据鸡偏嗜密码子将IBDV VP243基因进行密码子优化，优化后的IBDVVP243基因的序列如SEQ ID NO. I所示，在优化后的基因两端分别设计酶切位点，合成基因；(2)将合成的基因克隆到PUC19载体中，构建得到pUC19-optiVP243重组质粒；(3)将pUC19_optiVP243重组质粒进行酶切，获得optiVP243基因；(4)将optiVP243基因克隆到用同样酶酶切后的pCAGGS表达载体中，构建得到pCAGoptiVP243重组表达质粒，即为所述的DNA疫苗。在本专利技术的一个具体实施例中，步骤(I)中所述的酶切位点为EcoRI、ClaI。在本专利技术中，更优选的，所述的构建方法还包括对所述重组表达质粒 pCAGoptiVP243进行提取纯化。更进一步的，本专利技术还提供了所述的DNA疫苗在制备治疗或预防鸡传染性法氏囊病药物中的应用。与传统疫苗相比，本专利技术的DNA疫苗既拥有亚单位疫苗和灭活疫苗的安全性，又具有只有弱毒疫苗或重组疫苗才有的同时诱导体液免疫和细胞免疫应答的特点。附图说明图I为重组质粒pCAGoptiVP243 PCR和酶切鉴定；M:DLlkb Marker; I :pCAGoptiVP243 PCR鉴定；2:pCAGoptiVP243 EcoRl/Clal 双酶切结果图2为质粒转染DF-I细胞48h后间接免疫荧光检测；A:重组质粒pCAGoptiVP243转染孔；B:空载体pCAGGS转染孔；C:正常细胞对照图3为质粒转染DF-I细胞48h后Western blot检测；I:重组质粒pCAGoptiVP243转染孔；2:空载体pCAGGS转染孑L ;M:Proteinmolecular marker图4为IBDV DNA疫苗pCAGoptiVP243免疫后鸡体内抗体滴度检测结果。具体实施方式下面通过具体实施例对本专利技术做进一步说明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，绝不限制本专利技术的保护范围。实施列I表达传染性法氏囊病病毒多聚蛋白基因VP243的DNA疫苗的构建及表达I材料和方法I. I病毒株和细胞IBDV-HLJ0504株由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所禽免疫抑制病课题组分离鉴定并保存；PCAGGS载体和DF-I细胞由本实验室保存，可通过商业途径购买得到。I. 2仪器与试剂质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒购自omega公司；限制性内切酶和T4DNA连接酶购自Fermentas公司；Endofree质粒大提试剂盒购自Qiagen公司；紫外分光光度计购自 GE公司；大肠杆菌感受态ToplOF’由本实验室保存；Lipofectamine 2000转染试剂购自 invitrogen ；IBDV VP2单克隆抗体由本实验室保存；RIPA裂解液购自碧云天公司。I. 3重组表达质粒pCAGoptiVP243的构建根据鸡偏嗜密码子将IBDV VP243基因进行密码子优化，优化后的IBDV VP243 基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示，基因两端设计有EcoRI和ClaI酶切位点，设计完成后送金斯特公司合成并克隆入PUC19载体中，得到pUC19-optiVP243重组质粒，将 pUC19-optiVP243重组质粒进行EcoRI/Clal双酶切，获得optiVP243基因并亚克隆至同样用EcoRI/Clal双酶切后的pCAGGS表达载体中。对重组表达质粒pCAGoptiVP243进行双酶切鉴定，并进行测序，确定基因序列及读码框的准确性。I. 4重组质粒的提取纯化使用Endofree质粒大提试剂盒对重组表达质粒pCAGoptiVP243进行提取纯化,按使用说明进行。I. 5体外转染DF-I细胞将DF-I细胞饲养于六孔板内，所用培养液是含10%PAA胎牛血清的DMEM。待细胞生长至60-80%时，吸去培养液，用无双抗的Hank’ s液将细胞洗三次，再用少量的opti-MEM(Invitrogen)将待转染孔细胞洗一次，然后每孔加入I. 5ml opti-MEM,于 37°C CO2培养箱孵育Ih ;将4 μ I重组质粒pCAGoptiVP243 (质粒浓度为I μ g/ μ I)稀释于 246 μ Iopti-MEM 中；同时，取 10 μ I Lipofectamine 2000 稀释于 240μ1 opti-MEM 中，轻微混勻，室温孵育5min ;将稀释的质粒和Lipofectamine 2000在一个EP管中轻微混勻，室温孵育20min ;将质粒和Lipofectamine 2000混合液滴加于刚才处理过的DF-I细胞单层上， 置37°C CO2培养箱孵育；IOh后，吸去培养液，用含双抗的Hank’s液将细胞洗二次，每孔细胞加入2ml DMEM(含10%PAA胎牛血清和100U/ml双抗)置37°C CO2培养箱继续培养。48h 后收获细胞，进行western blot和间接免疫突光试验。同时设立pCAGGS空载体转染孔和正常细胞孔两个阴性对照。2 结果2. I 重组质粒 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种表达传染性法氏囊病病毒多聚蛋白基因VP243的DNA疫苗，其特征在于所述的DNA疫苗中含有SEQ?ID?NO.1所示的序列。
【技术特征摘要】
1.一种表达传染性法氏囊病病毒多聚蛋白基因VP243的DNA疫苗，其特征在于所述的DNA疫苗中含有SEQ ID NO. I所示的序列。2.如权利要求I所述的DNA疫苗，其特征在于所述的DNA疫苗是通过将SEQIDNO. I所示的序列克隆入pCAGGS表达载体中得到的。3.—种表达传染性法氏囊病病毒多聚蛋白基因VP243的DNA疫苗的构建方法，其特征在于包括以下步骤 (1)根据鸡偏嗜密码子将IBDVVP243基因进行密码子优化，优化后的IBDVVP243基因的序列如SEQ ID NO. I所示，在优化后的基因两端分别设计酶切位点，合成基因； (2)将合成的基因克隆到pUC...
【专利技术属性】
技术研发人员：王笑梅，高宏雷，高玉龙，祁小乐，秦立廷，王永强，
申请(专利权)人：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，
类型：发明
国别省市：
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