本发明专利技术公开了一种高通量DNA测序法用于测定人类基因组中短片段串联重复基因座的用途及方法，属于生物技术领域。该方法包括以下步骤：多样品基因座增殖子文库的准备；高通量DNA测序；数据分析及报告结果；本发明专利技术首次将高通量DNA测序技术应用于人类短片段串联重复（STR）基因座测定，明显提高了STR位点作为人类个体识别的分辨能力和灵敏度，同时极大地提高了STR检测的通量。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
，特别涉及一种高通量DNA测序法用于测定人类基因组中短片段串联重复基因座的用途及方法。
技术介绍
在法医、刑侦及物证鉴定等工作中如何追踪、认定嫌疑人；在犯罪、灾害等事件中如何判定相关人员或遇难者；在亲属认定中如何确定亲缘关系等等是人类文明史中早就出现并不断探索的目标。当100多年前遗传学由于孟德尔(G. J. Mendel)的奠基性工作而成为一门学科以后，随着遗传学的每一个进展都使上述的工作有了更坚实的科学基础。1985年英国遗传学家杰弗瑞斯(A. Jeffreys)首次提出所谓“DNA指纹”，指出在人类基因组中的某些区域具有重复序列，而且这类重复序列有个体差异(多态性)并能够遗·传。使用DNA来行使个体鉴定有许多优点=(I)DNA作为遗传信号的载体存在个体差异，表现为形状上的差异；(2)DNA作为遗传的载体又是稳定的、与亲缘关系的基础；(3)人体上任何有核的细胞都可以作为DNA分析的对象；(4) DNA样品的稳定性较好。最早用于检测遗传多态性的方法是使用限制性内切酶对人类基因组中可变数目串联重复(VNTR)做限制性片段长度多态性分析(RFLP)，但是这个方法的缺点在于需要较为完整(分解的程度较低)并较为大量的样品，这对法医现场来说有时无法实现，同时，该方法的分辨度也较低。随着技术的发展，DNA聚合酶链式反应(PCR)的出现使对样品量的需求大大降低，将分析目标集中到VNTR中的较短的重复序列(STR)，又使得较短的核酸片段也能够用于分析，加上多重PCR技术的应用，迅速使STR基因座的分型检测在法医和刑侦中迅速推广，并使收集相关人群STR分析结果的数据库日益扩大。上述基因组中同一位点上的多态性表现为在这一位点上有两个或多个不同的核酸一级结构(核苷酸的种类或重复序列的个数等)被称为等位基因，分析等位基因的结构被称为基因分型。等位基因越多基因型就会越多，如等位基因的数目为η,就意味着有η种纯合子和η(η-1)/2种杂合子。例如在某一位点上有10个等位基因，就应该存在10种纯合子和45种杂合子，即在这一位点上存在55种等位基因。在个体鉴定中需要同时检测多个位点(基因座)上的多态性，如果它们都是不连锁的，其基因座的频率可以相乘，如果提高基因座的数目就有可能大大提高个体鉴定的可信度。上世纪90年代以来对STR通用的检测方法是以多重PCR检测约20个基因座的基因型，在检测中使用以荧光标记的引物并设计好扩增子的长度，使所产生的不同长短的具有荧光标记的针对每个基因座的扩增子在毛细管电泳中分离，并与标准物进行比对，从而实现对每个基因座中的等位基因进行分型。但是，这种方法也存在着由于技术上的限制而带来的缺陷，主要有(1)由于荧光标记物的相互干扰和毛细管长度及成像技术等方面的限制，被分析基因座的数目已难以进一步大幅提升；(2)由于分析的对象是各个片段的长度大小，无法进一步检测到组成片段的核酸一级结构的微小差异，因此限制了检测的分辨度；(3)存在无效等位基因，致使不同的试剂盒有可能出现某些基因座测定结果的差异；(4)Stutter峰(片段分析中时而出现于主峰前的小峰)的干扰，尤其是存在混合样品时。DNA测序法可以解决上述STR分析方法中的困扰，提高基因分型的解析度。但用荧光标记双脱氧终止毛细管电泳法(Sanger法)来进行STR分型则由于通量、成本等方面的原因难以成为一种可用于日常测定的实际方法，特别是对于数据库的建设。
技术实现思路
本专利技术实施例的目的是针对上述现有技术的缺陷，提供一种可以经济有效的实现多样本、多个位点同时测定的设想，不仅提高了 STR检测的通量，同时提高了 STR位点作为人类个体识别的分辨能力和灵敏度。为了实现上述目的本专利技术采取的技术方案是 高通量DNA测序法用于测定人类基因组中短片段串联重复基因座的用途，包括在法医及其他涉及人类STR基因座检测的相关领域，如基因诊断、人类遗传图谱构建和群体遗传学研究等领域中的应用。本专利技术提供的另一个技术方案是以高通量DNA测序法测定人类基因组中短片段串联重复基因座的方法，包括以下步骤(I)多样品基因座增殖子文库的准备增殖子文库指两端连有不同接头的DNA片段，其中，一侧为测序接头可以含样本标签，以区分不同样本的测序结果；另外一侧为固定接头用于连接捕获颗粒，增殖子文库的制备方法采用扩增法或连接法a.扩增法用带有接头序列的特殊引物组合进行多个样品的多重PCR，得到带有相应接头的目的片段，组成样品文库；b.连接法应用普通引物组合进行多个样品的多重PCR后，通过平末端连接将相应接头连接到扩增子片段上，组成样品文库；(2)高通量DNA测序a.测序模板制备文库内容经一侧接头被固定在捕获颗粒上，每个颗粒携带一个单一的DNA片段；将携带模板的颗粒及PCR试剂与油相乳化，形成了油包水的微反应器；整个片段文库的扩增平行进行，形成测序模板；b. DNA测序采用高通量测序仪进行DNA测序；(3)数据分析及报告结果a.数据质控根据测序长度和质量，对原始数据进行过滤；b.测序信息归类根据测序结果中的样本标签序列信息进行，测序结果能够被有效归类至不同样本、不同STR位点的文件夹中；c.数据格式转换将高通量DNA测序结果转换成目前STR分型结果的标准格式，即以STR基因座核心重复序列的重复次数表示，该步骤通过制作某基因座的标准“阶梯比对参比序列”或直接读取核心重复次数等多种方法进行；另外根据与标准参考序列比对发现的样本序列的微变异也会有所展示，以更好的反映该STR位点的多态性。为了实现上述目的本专利技术采取的具体操作流程是(I)目的片段特异引物设计及验证人类基因组中存在大量重复序列，重复序列数量的差异决定不同个体的遗传特征。根据已公开的STR基因座序列信息进行引物设计，以测定未知样本中STR位点短片段串联重复次数。下表I列出40个常用于STR基因座的引物设计并实验证明其可用性。通常采用琼脂糖电泳对扩增产物的特异性和含量进行检测，采用测序法对扩增 产物序列的准确性进行检测，从而证明其可用性。表I 40个常用于扩增STR基因座的引物权利要求1.高通量DNA测序法用于测定人类基因组中短片段串联重复基因座的用途。2.以高通量DNA测序法测定人类基因组中短片段串联重复基因座的方法，其特征在于包括以下步骤 Cl)多样品基因座增殖子文库的准备 增殖子文库指两端连有不同接头的DNA片段，其中，一侧为测序接头可以含样本标签，以区分不同样本的测序结果；另外一侧为固定接头用于连接捕获颗粒，增殖子文库的制备方法采用扩增法或连接法 a.扩增法用带有接头序列的特殊引物组合进行多个样品的多重PCR，得到带有相应接头的目的片段，组成样品文库； b.连接法应用普通引物组合进行多个样品的多重PCR后，通过平末端连接将相应接头连接到扩增子片段上，组成样品文库； (2)高通量DNA测序 a.测序模板制备文库内容经一侧接头被固定在捕获颗粒上，每个颗粒携带一个单一的DNA片段；将携带模板的颗粒及PCR试剂与油相乳化，形成了油包水的微反应器；整个片段文库的扩增平行进行，形成测序模板； b.DNA测序采用高通量测序仪进行DNA测序； (3)数据分析及报告结果 a.数据质控 根据测序长度和质量，对原始数据本文档来自技高网...
【技术保护点】
高通量DNA测序法用于测定人类基因组中短片段串联重复基因座的用途。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：周骋，姚志建，潘雅姣，陈琛，
申请(专利权)人：北京爱普益生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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