鸡新城疫病毒HN基因亚单位疫苗及其制备方法技术

本发明专利技术涉及一种鸡新城疫病毒I-IN基因亚单位疫苗，其主要材料由鸡新城疫病毒I-IN基因和原核表达载体pET-28a组成，该疫苗由鸡新城疫病毒HN基因与原核表达载体pET-28a连接构建重组载体质粒，再经诱导表达、蛋白纯化、收获目的蛋白，配合佐剂而得。本发明专利技术通过采用基因工程等先进技术，研发鸡新城疫病毒I-IN基因亚单位疫苗，利用pET-28a作基因表达载体，与具有良好免疫原性的鸡新城疫病毒HN基因连接构建重组载体质粒。该疫苗的生产技术具有安全、稳定、可规模化等优点，疫苗能够达到良好的预防效果。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物基因工程疫苗
，具体涉及一种鸡新城疫病毒HN基因亚单位疫苗及其制备方法。
技术介绍
近年来，由于科技的巨大进步，使得养殖业得以迅速发展，但同时也带来了隐患。科技的进步使养殖业向集约化和工厂化发展，畜禽对病原微生物的易感性增加，病害频繁发生，交叉感染，混合感染严重，在生产上造成很大的经济损失。随着养鸡业的发展，大型集约化鸡场的相继出现，随之而来的疾病问题也接踵而至，各种畜禽疾病频繁发生，由于各养殖场的技术力量参差不齐，诊断检测设备也很有限，导致许多临床兽医在用药方面较为混乱，滥用和无针对性的用药问题成为普遍现象。这样 就进一步促使细菌耐药株不断产生，畜禽疾病的预防和治疗更加困难，甚至治疗无效。众所周知，迄今为止病毒性传染病还没有有效的治疗方法，近几年因各种疾病死亡的畜禽至少占饲养总数的8 10%。目前病毒性传染病主要靠接种疫苗来进行预防和治疗，为此我国投入了大量人力、财力开发各种疫苗产品，对控制疾病流行起到了关键作用。新城疫(Newcastle disease，ND)是一种由新城疫病毒引起的禽类高度接触性、急性败血性传染病，是目前危害养禽业发展最严重的传染病之一，又称亚洲鸡瘟或伪鸡瘟。常呈急性败血鸡新城疫症状。主要特征是呼吸困难、便稀、神经紊乱、粘膜和浆膜出血，死亡率闻，对养鸡业危害严重。有强毒株和弱毒株两类，病毒分为低毒力型(即缓发型)、中等毒力型(即中发型)、强毒力型(即速发型)三种类型。多数高强度毒力株常属嗜内脏型新城疫病毒。鸡科动物都可患罹本病，家鸡最易感，雏鸡比成年鸡易感性更高。因此，目前对鸡新城疫病主要以预防为主，疫苗在新城疫病的预防上发挥着重要的作用。HN基因是鸡新城疫病毒的主要结构蛋白，具有良好的免疫原性和反应原性。因此，构建能高效表达鸡新城疫病毒HN基因的亚单位疫苗，为我国鸡新城疫病的防治提供了新了思路与手段。目前，新城疫在全国范围内的发生仍然比较普遍。对于该病的控制，接种疫苗仍是主要手段，常用的鸡新城疫疫苗有活疫苗，需多次接种，但此方法有一定的副作用，可能引发疾病；灭活疫苗能够诱导机体产生有效的免疫应答反应，产生高水平的抗体并持续较长时间，但接种灭活疫苗的机体产生的针对病毒的特异性抗体，干扰了临床检测和检疫以及流行病学调查；基因工程疫苗的应用大大改善了传统疫苗出现的弊端，其中亚单位疫苗具有良好的免疫原性，且无副作用、不干扰临床检测和流行病学调查，因此具有良好的应用前旦-5^ O
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一种鸡新城疫病毒HN基因亚单位疫苗及其制备方法。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案一种鸡新城疫病毒HN基因亚单位疫苗，其主要材料由鸡新城疫病毒HN基因和原核表达载体pET-28a组成，该疫苗由鸡新城疫病毒HN基因与原核表达载体pET_28a连接构建重组载体质粒，再经诱导表达、蛋白纯化、收获目的蛋白，配合佐剂而得。所述鸡新城疫病毒HN基因亚单位疫苗的制备方法，其包括如下步骤I)从自然发病的鸡新城疫病毒中，通过PCR扩增出具有良好免疫原性的HN基因；2)将HN基因与原核表达载体pET_28a连接，构建重组载体质粒(pET-HN)；3)利用IPTG诱导重组载体质粒(pET-HN)产生大量目的蛋白；4)用SDS-PAGE电泳检测目的基因的蛋白的表达量；5)进行westerm-blotting技术来检测目的蛋白的反应原性；6)利用蛋白纯化技术对HN蛋白进行纯化；7)收获目的蛋白，配合佐剂(壳聚糖)免疫动物检测目的蛋白的免疫原性。所述的鸡新城疫病毒HN基因是以鸡新城疫病毒基因组为模板进行RT-PCR扩增与克隆、并由重组菌进行诱导表达而得。本专利技术的研究内容主要包括利用原核表达载体，筛选具有良好免疫原性的鸡新城疫病毒HN基因作为靶基因，并对HN基因进行克隆、鉴定；构建能高效表达HN基因的原核表达载体，利用IPTG诱导其产生大量目的蛋白，SDS-PAGE电泳检测目的基因的蛋白表达量，western-blotting技术检测目的蛋白的反应原性，摸索探讨最佳诱导时间和诱导剂量，利用蛋白纯化技术对HN蛋白质进行纯化，收获目的蛋白，配合佐剂免疫动物检测目的蛋白的免疫原性。本专利技术通过采用基因工程等先进技术，研发鸡新城疫病毒HN基因亚单位疫苗，利用pET-28a作基因表达载体，与具有良好免疫原性的鸡新城疫病毒HN基因连接构建重组载体质粒。该疫苗的生产技术具有安全、稳定、可规模化等优点，疫苗能够达到良好的预防效果。本疫苗的研制和应用，开拓了生物医药研发的新方向，使新一代动物生物制品更加安全、廉价、使用方便，有利于促进我国家禽养殖业的发展，造福广大人民，对促进社会和经济进步意义重大，具有很好的社会和经济效益。附图说明图I中1-6为HN基因PCR扩增产物，M为Mark2000 ；图2为重组质粒(pET-HN)及重组质粒的EcoRI和HindIII双酶切鉴定；图3为表达蛋白SDS-PAGE电泳结果，I :标准低分子量蛋白质Mark ;2、3 :pET_HN重组菌的诱导表达；4 pET-28a载体的诱导表达；5 :未加IPTG诱导剂的pET-HN重组菌对照；图4为表达产物的Westem-bloting鉴定，I :pET_HN表达蛋白的Western-blot检·测；2 :标准低分子量蛋白质Mark。具体实施例方式以下通过实施例对本专利技术进行详细说明，但本专利技术的保护范围不限于此。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。实施例I(一 )鸡新城疫HN基因的扩增与克隆根据gene bank上已发表的鸡新城疫病毒HN基因组序列，设计了一对包含其结构蛋白HN基因的PCR引物，引物Pl带有EcoRI酶切位点，引物P2带有HindIII酶切位点，Pl和P2引物之间所扩增片断长约1.8Kp。引物由宝生物工程(大连)有限公司合成。引物序列如下Pl 5 ; 一 ACAACATCCGTTCTACCACATCAC C — 3 'P2 5 ; 一 GTCGTCTTCCCAACCATCCTATGAT 一 3 '。( 二 )鸡新城疫病毒基因组RNA的提取按照宝生物RNA试剂盒提取法对其RNA进行提取。(三)RT-PCR及目的片段的回收以P1、P2为引物，以鸡新城疫病毒基因组为模板进行RT-PCR扩增，RT-PCR反应 采用50 μ L反应体系，在50 μ L反应体系中加入10XPCR buffer 5 μ L，dNTP 2yL，模板I μ L,上、下游引物各I μ L, Taq酶O. 5 μ L,灭菌水39. 5 μ L,总体积50 μ L。混合均匀后盖紧管口放入PCR仪内扩增反应，RT反应条件如下70°C，5min，42°C，lh ;95°C，5min ; 4°C,5min。PCR反应条件94°C预变性5min后进入循环，94°C变性I min，58°C退火I min，72°C延伸2. 5min，30个循环后，72°C再延伸IOminj I %的琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物，用tiangen凝胶回收试剂盒回收PCR产物，得到约I. 8Kp的PCR产物(见图I)。(四)重组载体质粒(pET-HN)的构建用EcoR I和Hind III将PCR扩增回收的HN基因及目的载体pE T _28a双酶切，然后进本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种鸡新城疫病毒HN基因亚单位疫苗，其特征在于：其主要材料由鸡新城疫病毒HN基因和原核表达载体pET？28a组成，该疫苗由鸡新城疫病毒I？IN基因与原核表达载体pET？28a连接构建重组载体质粒，再经诱导表达、蛋白纯化、收获目的蛋白，配合佐剂而得。

【技术特征摘要】
1.一种鸡新城疫病毒HN基因亚单位疫苗，其特征在于其主要材料由鸡新城疫病毒HN基因和原核表达载体pET-28a组成，该疫苗由鸡新城疫病毒I-IN基因与原核表达载体pET-28a连接构建重组载体质粒，再经诱导表达、蛋白纯化、收获目的蛋白，配合佐剂而得。2.权利要求I所述鸡新城疫病毒HN基因亚单位疫苗的制备方法，其特征在于，包括如下步骤 1)从自然发病的鸡新城疫病毒中，通过PCR扩...

【专利技术属性】
技术研发人员：张遂平，周红霞，杨慧敏，郭芳茹，王菊萍，牛咏梅，
申请(专利权)人：河南亚卫动物药业有限公司，
类型：发明
国别省市：