新方法技术

本发明专利技术提供了从革兰氏阴性细菌细胞提取脂多糖(LPS)的方法，所述方法包括下列步骤：在包含水、醇和其它有机溶剂的组合物(LPS提取组合物)中从细胞培养物提取LPS。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】专利
本专利技术涉及脂多糖(LPS)的生物合成制备领域。具体地，本专利技术涉及用于从细菌细胞，诸如通过细菌细胞培养获得的细胞提取LPS的改进的方法和组合物。本专利技术的这些方法和组合物用于制备LPS、LPS衍生物，并且特别是用于制备3-O-脱酰单磷酰脂质A (3D-MPL)。背景脂多糖(LPS)是革兰氏阴性菌外膜的外部小叶(external leaflet)的主要的表面分子，并且只存在于所述外部小叶中。LPS阻止了血清补体和吞噬细胞产生的细菌的破坏，并且与用于集落(colonisation)的粘附有关。LPS是大小约为10,000道尔顿的一组结构相关的复杂分子，并且由三个共价连接区域组成(如图5所示)：(i) 在外部区域的O-特异性多糖链(O-抗原)(ii) 核心寡糖中心区域(iii) 脂质A - 充当疏水性固定物(anchor)的最里面的区域，其包括运载长链脂肪酸的氨基葡萄糖二糖单元。专利技术概述本专利技术的一个目的是提供用于提取LPS的组合物和方法，其导致改进的LPS的细菌产率。可以从产生的细菌细胞的量(生物量)计算LPS产率。改进的LPS产率能够使在给定的设备中制备更大量的LPS，或者使用较小设备制备等量的LPS。本专利技术的另一目的是提供用于提取LPS的方法，其显示出从细菌细胞提取的LPS产率的更大可靠性和/或再现性。本专利技术的另一目的是提供用于提取LPS的更快的方法。因此，提供了从革兰氏阴性菌细胞提取脂多糖(LPS)的方法，所述方法包括下列步骤：使用包含水、醇和其它有机溶剂的组合物(LPS提取组合物)从细菌的细胞膜提取LPS。附图简述图1在50℃从细胞肉汤培养基101B提取的动力学图2 来自肉汤培养基101B的再现性数据图3A：具有0%水的80个实验的提取产率的分布图3B：具有1%的水的55个实验的提取产率的分布图4 pH的影响图5显示了LPS分子的三个共价连接区域：(i) 在外部区域的O-特异性多糖链(O-抗原)；(ii) 核心寡糖中心区域；和(iii) 脂质A图6显示了突变体明尼苏达沙门氏菌(S. Minnesota)R595产生的截短的LPS，并且指出了相对于全长LPS的截断位置。具体实施方式LPS提取的已知技术包括Galanos方法，其涉及用苯酚、氯仿和石油醚的混合物(PCP)提取LPS，然后蒸发氯仿和石油醚，添加丙酮和水以沉淀LPS，并且通过离心或过滤回收LPS(Galanos et al., Eur. J. Biochem. 9: 245 (1969))。Chen方法涉及用氯仿和甲醇的混合物(CM)提取LPS，然后进行一系列的甲醇沉淀步骤。Galanos不适合商业制备LPS，因为其不适于大规模生产，并且使用引起健康和安全担忧的溶剂混合物(例如，苯酚：氯仿：石油醚)。Chen方法产生富含LPS和磷脂的CM相，其通常需要多个沉淀步骤以获得具有足够纯度以用于免疫刺激应用(例如用作疫苗佐剂)的LPS。WO02/078637公开了使用革兰氏阴性菌(特别是明尼苏达沙门氏菌(Salmonella minnesota))的深度粗糙的(deep rough)突变体菌株制备LPS和3D-MPL的方法。WO02/078637的方法显示了从2%变至12%的产率上的显著可变性。需要改进的LPS提取方法。专利技术人已经揭示除了醇和其它有机溶剂外，通过在LPS提取步骤中使用水，与其中在LPS提取步骤中不使用水的等效步骤相比，能够得到较高的LPS产率。本专利技术人已经证明了可以通过使用包含水的提取组合物从革兰氏阴性菌提取脂多糖，其产生更多的LPS，具有更大的可靠性并且经历较短的时间(与缺水的等效组合物相比)，并且没有与其它提取方法相关的某些缺点。除了增加的LPS产率以外，本专利技术人还揭示了通过在LPS提取组合物(水、醇和有机溶剂)中使用水，能够以比没有水时更大的可靠性并且在较少时间内实现这种较大产率。如本文所用的术语“LPS产率”是指以干燥细菌细胞重量(DCW)的百分数的形式获得的LPS的量。因此，提供了从细菌细胞培养物提取脂多糖(LPS)的方法，所述方法包括下列步骤：使用包含水、醇和其它有机溶剂的LPS提取组合物从所述细胞提取LPS。“LPS提取”或“从细菌细胞提取LPS”是指LPS被直接从细菌外膜除去。在本专利技术的另一方面中，提供了LPS提取组合物。“LPS提取组合物”是指其中从细菌的膜直接提取脂多糖的LPS提取步骤中使用的组合物/混合物。本专利技术的LPS提取组合物包含水、醇和其它有机溶剂，并且用于本专利技术的LPS提取方法。本专利技术的LPS提取组合物是单相提取组合物。“单相”是指液体形成单一均匀溶液而非其中液体是不能混溶的混合物。术语“水”(H2O)是本领域技术人员熟知的。该术语包括纯的和基本纯的水(H2O) (包括通过蒸馏、去离子、离子交换处理或反渗透获得的水)，以及包含少量杂质的水(本领域技术人员清楚水通常包含某些杂质)。水杂质是本领域技术人员熟知的并且包括无机离子、有机分子、微粒、胶体、溶解的气体、微生物及其副产物。在特定的实施方案中，水是无菌的，因为其基本上没有任何活的微生物。在进一步的实施方案中，水是过滤过的。本专利技术可以进一步使用水溶液，例如进一步包含碱的水。在一个实施方案中，本专利技术的组合物不包含其中溶解了酸的水。因此，在一个实施方案中，水的pH是中性的，即约pH 7。在本专利技术的一个实施方案中，提供了LPS提取组合物，其包含水、醇和有机溶剂，其中水的pH在7以上。在本专利技术的特定实施方案中，提供了LPS提取组合物，其中LPS提取组合物的pH不低于7。在特定的实施方案中，可以通过加入选自的氢氧化钠(NaOH)、三乙胺(TEA)和碳酸氢钾(KHCO3)的一种或多种的碱提高水的pH。术语“水”还包括去离子水。去离子水是本领域技术人员熟知的术语，但是简言之，去离子水是其中基本除去了所用矿物离子的水。可以通过电导率测量去离子的水平，并且在特定的实施方案中，去离子水的最大电导率为1 μ西门子(siemens)/cm。本专利技术的水不必须与LPS提取组合物的其它组分分别添加。例如，LPS提取组合物中的水可以源自包含醇和水二者的醇溶液，并且因此，技术人员仅需要混合醇和有机溶剂来提供包含醇、有机溶剂和水的LPS组合物。正如已经指出的，本专利技术人已经揭示了向包含醇和其它有机溶剂的提取组合物中添加水导致更大的LPS产率和/或更大的LPS产率的一致性。因此，提供了包含水、醇和其它有机溶剂的LPS提取组合物，其中LPS提取组合物中水的量为约0.1-约1.5% (v/v)。本专利技术的LPS提取组合物可以包含约0.4%-1.5%的水(v/v)，例如0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4或1.5% (v/v)。特别地，本专利技术的LPS提取组合物中水的量为约1% (v/v)，即0.8-1.2% (v/v)。本专利技术的LPS提取组合物包含除了醇以外的有机溶剂。术语“有机溶剂”是本领域熟知的。有机溶剂为能够将本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2010.05.20 GB 1008401.01.LPS提取组合物，其包含水、醇和其它有机溶剂。
2.如权利要求1所述的组合物，其中所述LPS提取组合物是单相的。
3.如权利要求1或2所述的组合物，其中所述LPS提取组合物中水的量为约0.1-约1.5% (v/v)。
4.如权利要求1-3中任一项所述的组合物，其中水的量为约1% (v/v)。
5.如权利要求1-3中任一项所述的组合物，其中水的量为约0.5% (v/v)。
6.如权利要求1-5中任一项所述的组合物，其中所述醇选自下列：甲醇、乙醇、异丙醇或丁醇。
7.如权利要求1-6中任一项所述的组合物，其中所述LPS提取组合物中醇的百分数为约5%-约40% (v/v)。
8.如权利要求7所述的组合物，其中醇的百分数为约10% (v/v)-约30% (v/v)。
9.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述其它有机溶剂选自下组：氯仿、链烷、甲苯和石油醚。
10.如权利要求9所述的组合物，其中所述链烷选自下组：异辛烷、乙烷、庚烷和己烷。
11.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述LPS提取组合物中其它有机溶剂的百分数为约60% (v/v)-约95% (v/v)。
12.如权利要求11所述的组合物，其中其它有机溶剂的百分数为约75% (v/v)-约90% (v/v)。
13.如权利要求1-12中任一项所述的组合物，其中LPS提取溶液包含氯仿、甲醇和水。
14.如权利要求1-12中任一项所述的组合物，其中所述LPS提取组合物包含链烷、乙醇和水。
15.用于从革兰氏阴性细菌细胞提取LPS的如权利要求1-14中任一项所述的组合物。
16.如权利要求1-14中任一项所述的LPS提取组合物在用于从革兰氏阴性细菌细胞提取LPS的方法中的用途。
17.从革兰氏阴性细菌细胞提取脂多糖(LPS)的方法，所述方法包括在如权利要求1-14中任一项所述的LPS提取组合物中从所述细胞提取LPS的步骤。
18.如权利要求17所述的方法，其中在约35℃-约65℃的温度进行LPS的提取。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述温度为...

【专利技术属性】
技术研发人员：P查理斯，G格尔德霍夫，V曼库索，
申请(专利权)人：葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司，
类型：
国别省市：