一种贝肉中16种脂溶性贝类毒素的液质联用检测方法，包括样品处理、净化、测定条件、定性测定和定量测定。本发明专利技术检测方法采用甲醇提取，固相萃取柱净化，进行贝肉中16种脂溶性贝类毒素的同时检测。方法操作简单方便，净化效果好，整体回收率高，重现性强，同时节省了有机溶剂和处理时间，简化了样品的前处理过程。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种脂溶性贝类毒素的检测方法，特别是一种
技术介绍
海洋生物毒素(贝类毒素)特指主要由海洋有毒微藻或微生物产生、能够在海洋生物尤其是双壳贝类中富集的、对其他生物包括人类产生危害的一大类小分子有毒化学物质。针对这些生物毒素，研究者初期主要根据所引起的中毒症状将其分为六大类麻痹性贝类毒素(Paralytic Shellfish Poisoning, PSP)、腹湾性贝类毒素(DiarrheticShellfish Poisoning, DSP)、神经性贝类毒素(Neurotoxic Shellfish Poisoning, NSP)、·记忆缺失性贝类毒素(Amnesic Shellfish Poisoning,ASP)、西加鱼毒素(Ciguatera FishPoisoning, CFP)、蓝绿藻毒素。不过随着研究的深入，新的生物毒素种类不断被发现，且多种毒素如OA往往与毒素AZA和PTX伴生而成，但具有不同的致毒机理，原有分类方法已不能满足管理和科研的需求。因此，2004年，由联合国粮农组织、世界卫生组织和政府间海洋委员会共同组建的双壳类软体生物毒素工作组将贝类毒素分为八大类，分别为石房蛤毒素组(Saxitoxin, STX)、软骨藻酸组(Domoic acid, DA)、大田软海绵酸毒素组(Okadaicacid, 0A)、原多甲酸毒素组(Azaspiracid, AZA)、短裸甲藻毒素组(Brevetoxin, BTX)、蛤毒素组(Pecenotoxins, PTX)、虫下夷扇贝毒素组(Yessotoxin, YTX)和环亚胺类毒素(Cyclicimines,CIs)。除此之外，水螅毒素(Palytoxins,P1TX)和西加鱼毒素(Ciguatoxins,CTX)也正在被考虑是否划作贝类毒素中。现有8大类贝类毒素中，STX和DA毒素组较易溶解于水，比较而言0A、AZA> BTX、PTX、YTX、CIs均为聚醚类物质，具热稳定性，易溶解于甲醇、乙醚等非极性有机试剂中，因此被统一称作为脂溶性贝类毒素(lipophilic phycotoxins，LPs)。LPs的脂溶性导致这类毒素在贝类等生物体中的消除半衰期长达数十天甚至数月，在贝类肌肉、内脏团等组织中的分布不具有显著的组织差异性，且加热、微波等常规加工方式因降低水产品中的水分含量而导致毒素浓度更高，因此这类毒素对消费者带来的潜在危害更难预防，已成为欧盟等发达国家制定贸易和技术壁垒的重要关注点。现有的检测技术主要还是小鼠生物法，存在动物福利以及检出限高且不能明确辨析贝毒成分等问题，虽然质谱检测技术也已开始用于贝类毒素的检测，但检测种类比较单一，或前处理方法尚需进一步完善。因此建立一种快速、灵敏、准确的多种脂溶性贝类毒素同时检测方法变得尤为重要。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种方法针对性强、操作简单、准确快速、检测面广、测试成本低、易于推广应用的。本专利技术所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。一种，包括样品处理、净化、测定条件、定性测定和定量测定，其具体步骤如下(I)样品处理精确称取样品后，加入甲醇，涡旋混合，超声提取，离心取上清液，残渣中加入甲醇,重复提取一次,合并两次提取液,于40°C氮气吹至约lmL，加入3mL水涡旋混匀，超声Imin ；(2)净化依次用ImL甲醇、ImL 30%甲醇水溶液活化Strata _X固相萃取柱，注入提取液，再用ImL 20%甲醇水溶液淋洗，最后用ImL O. 3%氨水甲醇溶液洗脱，收集洗脱液，甲醇定容至lmL，洗脱液过O. 22 μ m滤膜后，供液相色谱-串联质谱分析；(3)测定条件待测样品用液相色谱-串联四极杆质谱进行测定，仪器参数条件见表1，选择反应监测母离子、子离子和碰撞能量见表2 ； 表I液相色谱-串联四极杆质谱的仪器参数条件 相色谱条，色谱柱__C18 柱，100 mm X 2.1 mm (i.d·), 3.5 μιη_ 流动相 0.15°/。甲酸水溶液(A),乙腈溶液(B) 流速0.30mL/min 进样量 5 μ 梯度洗脱程时间(min)A (%) B (%)序 0.01— 90 10—5.0010 90一 5.01~ 10 907.00— 10 90■一 10.00— 90 10_ 15.00I 90 I10质谱参考条件__离子源电喷雾离子源 扫描方式ESI-/ESI+切换扫描监测方式多反应监测(MRM) 电喷雾电压(IS)5500V气帘气压力(CUR)高纯氮气，15 一雾化气压力(GSI)高纯氮气，50 — 辅助气流速(GS2)高纯氮气，40 离子源温度(TEM)—高纯氮气，550°C碰撞气(CAD)高纯氮气，10表2选择反应监测母离子、子离子、碰撞能量和扫描方式毒奉名称简称 QiMassQ3 Mass~ ^^ ~扫模式喊祝小__(Da)(Pa)(volts)(volts) ^ AZA-I ~ 842.5 824.55040 一正离子 AZA-I ~ 842.5 806.5*5055正离子 AZA-2 856J 83815040正离子原多甲酸母素 h-------·TO— 50~I离手— AZA-3__828.5 810.5__60__40正离子 _ AZA-3 ~ 828.5 ~ 792.5*50 50正离子— PTX-2 — 876.4212.7* 40 50' 正离子— _ _ PTX-2 ~ 876.4 823.0 40 —_30正离子 ~环亚胺类毒奉GYM508Γ 174.1* ~ 6030 正离子_M妝哭母系GYM508.3490.36050正离子本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种贝肉中16种脂溶性贝类毒素的液质联用检测方法，包括样品处理、净化、测定条件、定性测定和定量测定，其特征在于具体步骤如下：(1)样品处理：精确称取样品后，加入甲醇，涡旋混合，超声提取，离心取上清液，残渣中加入甲醇，重复提取一次，合并两次提取液，于40℃氮气吹至约1mL，加入3mL水涡旋混匀，超声1min；(2)净化：依次用1mL甲醇、1mL？30％甲醇水溶液活化StrataTM？X固相萃取柱，注入提取液，再用1mL？20％甲醇水溶液淋洗，最后用1mL？0.3％氨水甲醇溶液洗脱，收集洗脱液，甲醇定容至1mL，洗脱液过0.22μm滤膜后，供液相色谱？串联质谱分析；(3)测定条件：待测样品用液相色谱？串联四极杆质谱进行测定，仪器参数条件见表1，选择反应监测母离子、子离子和碰撞能量见表2；表1液相色谱？串联四极杆质谱的仪器参数条件表2选择反应监测母离子、子离子、碰撞能量和扫描方式(4)定性测定在同样测试条件下，试样溶液中脂溶性贝类毒素的保留时间与标准物质保留时间相对偏差在±5％以内，且检测到的定性离子的相对丰度，应与浓度相当的标准溶液中定性离子的相对丰度一致；基峰与次强碎片离子丰度比应符合表3要求；表3基峰与次强碎片离子丰度比要求？？次强碎片离子相对丰度％？？＞50？？＞20～50？？＞10～20？？≤10？？允许相对偏差％？？±20？？±25？？±30？？±50(5)定量测定将混合标准工作液和试样溶液等体积进样测定，按外标法使用标准工作曲线对样品进行定量，试样溶液和标准溶液中脂溶性贝类毒素的响应值均应在仪 器检测的线性范围内；试样中脂溶性贝类毒素各组分含量按如下计算，计算结果需扣除空白值，结果保留三位有效数字；式中：X？试样中脂溶性贝类毒素各组分含量，单位为微克每千克；c？试样溶液中脂溶性贝类毒素各组分的浓度，单位为纳克每毫升；V？试样溶液最终体积，单位为毫升；m？试样质量，单位为克。FSA00000788734700031.tif...
【技术特征摘要】
1. 一种贝肉中16种脂溶性贝类毒素的液质联用检测方法，包括样品处理、净化、测定条件、定性测定和定量测定，其特征在于具体步骤如下 (1)样品处理精确称取样品后，加入甲醇，涡旋混合，超声提取，离心取上清液，残渣中加入甲醇，重复提取一次，合并两次提取液，于40°c氮气吹至约lmL，加入3mL水涡旋混勻，超声Imin ； (2)净化依次用ImL甲醇、ImL30%甲醇水溶液活化S...
【专利技术属性】
技术研发人员：谭志军，吴海燕，郭萌萌，李兆新，王联珠，翟毓秀，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院黄海水产研究所，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。