本发明专利技术涉及蛋白质和/或其片段和衍生物及它们在疫苗和生物技术方法中的应用。该疫苗特别包括从牛蹄炎分离出的密螺旋体的免疫原性蛋白质。本发明专利技术进一步涉及针对所述蛋白质或其片段的抗体，和所述蛋白质在诊断方法中的应用，其中检测所述抗体作为牛蹄炎的标志。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】本专利技术涉及蛋白质和/或其片段和衍生物及它们作为疫苗和在生物技术方法中的应用。所述疫苗特别包括从牛蹄炎(digital dermatitis)分离出的密螺旋体(Treponemaspp.)的免疫原性蛋白。本专利技术进一步涉及针对所述蛋白质或其片段产生的抗体，和所述蛋白质在诊断方法中的应用，其中检测抗体作为牛蹄炎的标志。
技术介绍
蹄炎(DD)是一种引起牛跛行的传染性蹄病，其在集约化奶牛场生产中最为常见。该疾病最初于1974年在意大利公开。最近在瑞典公开了患有蹄炎的第一个畜群Hinstr0m和Bergsten，2005)，而以前只有零星的、非典型病例报告(Manske等，2002)。湿/脏的蹄环境和DD的发生率之间有强的联系(Rodriguez-Lainz等，1996)，例如在隔间系统中小巷内的粪便和尿液的堆积是一个典型的卫生问题。除了动物健康问题外，由于牛奶产量的减少和体重减轻导致的经济损失也与DD相关(Losinger，2006)。对DD病变抗生素治疗的快速反应强烈的地支持细菌为病因。已经从DD病变中分离出来许多不同属的细菌，如密螺旋体属(Treponema),梭杆菌属(Fusobacterium),Dichelobacter,普氏菌属(Prevotella)和Prophyromonas已经从DD病变中分离出来，经常讨论多种微生物的病因。但是，有强有力的旁证证明密螺旋体是DD疾病的主要病因。早在1964年从牛的表现为“脚腐烂”表现的不同变种的涂片中观察到螺旋体(Gupta等，1964)。另一个螺旋体的早期观察是在1988年，当时DD在英国第一次被公开时(Blowey和Sharp，1988)。最早的来源于DD的第一个螺旋体培养物在1995年被报道(Walker等，1995)。在DD病变组织的组织学制备物中，发现密螺旋体侵入较深层表皮(Moter等，1998)。已经被证实在感染的牛中产生额外的针对密螺旋体的体液免疫反应(Walker等，1997 ；TiOtt等，2003)。在1966年公开了通过DD病变的新鲜刮擦接种使疾病成功实验性传播(Read和Walker，1996)。也通过组织病理学证实在接种后1_2周螺旋体侵入组织(Read等，1998)。密螺旋体的几个种系型可以存在于相同的病变中。已经从相同的动物中分离出了不同的种系型(Walker等，1995 ;Evans等，2008)和通过16S rRNA基因的克隆和测序，在来源于四头母牛的混合样品中，确定了五种不同的种系型(Choi等，1997)。通过DD病变活检的荧光原位杂交也已经证明了不同种系型之间在真皮层中分布的不同(Moter等，1998)。溃蚀齿样密螺旋体(Treponema phagedenis-like)种系型主要分布在角质层和棘层。一些种系型也还没有培养的报道。近来在一些研究中，溃蚀齿样密螺旋体种系型已经被确定是DD 发病机制的关键因素(Klitgaard 等· 2008，Nordhoff 等· 2008，Yano 等· 2009)。在DD广泛传播的国家中，经常使用含有抗生素的足浴。这些足浴迅速被粪便和污物污染，因此起到抗生素耐药性细菌的高选择性培养的作用。在瑞典使用四环素，但是仅用于个体动物的局部治疗，因此推荐含硫酸铜的畜牧水平足浴。至今还没有用于DD的商业疫苗或血清学检测。针对密螺旋体的体液应答已经被证实存在于患有DD的牛中，并在研究中用于全细胞裂解物ELISA调查(Demirkan等.1999，Trott等· 2003，Vink等· 2009，Walker等· 1997)。在21世纪早期的若干年，诺华公司生产了用于美国市场的全细胞裂解物DD疫苗(Tr印Shield) (Berry等.2004，Keil等.2002)。疫苗开发的技术和策略描述于i. a. Vaccine Design Innovative Approachand Novel Strategies(Caister Academic Press,2011)和 Vaccines :From Concept toClinic A Guide to the development and Clinical Testing of Vaccines for HumanUse (Informa Healthcare, 1998)。在1997年Erdile等描述了重组蛋白作为疫苗的应用。专利技术简述本专利技术的目的在于提供有效的用于动物皮炎，特别是反刍动物中的蹄炎的诊断和免疫保护方法，以及用于所述目的的产品。本专利技术围绕从牛蹄炎中分离的密螺旋体的免疫原性蛋白，更具体的是重组蛋白。在第一个方面，本专利技术涉及分离的溃蚀齿样密螺旋体蛋白，TmpA、Ttm和PrrA,分别具有根据SEQ ID N0:2、SEQ ID NO :4或SEQ ID NO :6的氨基酸序列，涉及能够诱导对密螺旋体的免疫应答的片段和衍生物，和涉及能够结合由对象在针对所述蛋白的免疫应答中所产生的抗体的片段和衍生物，其如下进一步定义。在本专利技术的一个实施方式中，密螺旋体蛋白和其片段和衍生物是重组产生的。在一个方面，本专利技术涉及编码本专利技术的蛋白质、片段和衍生物的核酸分子。本专利技术还涉及所述蛋白质、其片段和衍生物在兽药中的应用，特别是作为用于预防蹄炎的疫苗。在另一方面，本专利技术提供一种用于预防蹄炎的兽用疫苗，其包含一或多种所述重组蛋白和/或其活性片段，和常规的和适宜的佐剂。为了得到更广的免疫应答，该疫苗可能进一步包括或不包括其它的密螺旋体免疫原或不同的密螺旋体的全细胞裂解物。根据另一个方面，本专利技术还涉及一种在动物中预防蹄炎的方法，包括给有需要的动物施用所述疫苗的步骤。根据仍然另一方面，提供一种用于检测样品中针对密螺旋体的抗体的存在的方法，其中所述重组蛋白和/或活性片段用于检测样品中针对密螺旋体的抗体的存在。根据仍然另一方面，提供一种用于诊断动物中蹄炎的方法，其中所述重组蛋白和/或活性片段被用于检测动物中针对密螺旋体的抗体的存在。在所述检测方法或诊断方法的实施方式中，所述重组蛋白和/或活性片段用于ELISA(酶联免疫吸附测定)方法中。在一个方面，本专利技术涉及针对所述免疫原性蛋白或其免疫原性衍生物或片段的抗体。这种抗体在通过被动免疫方式治疗由密螺旋体所引起的疾病中是有用的，和在例如密螺旋体的免疫磁性分离的多种实验室方法中也是有用的。附图简述图I :重组溃蚀齿样密螺旋体菌株Vl免疫原性蛋白TmpA、Ttm和PrrA作为抗原的酶联免疫吸附测定。用来自患有急性蹄炎(黑条)的8只奶牛、蹄炎病史未知的2只奶牛和6-7个月大的5只小牛(灰色)的血清进行该测定。缀合辣根过氧化物酶(HRP)的兔抗牛 IgG 抗体(Sigma) (A)或单克隆 22 : 26 抗牛 IgG-HRP 抗体(Svanova Biotech AB) (B)用作二抗。在450nm下测得校正的光密度值。定义“免疫原性剂”或“免疫原”能够在给对象施用时诱导针对自身的免疫应答，任选地与佐剂组合。如在本说明书中使用的“活性片段”或“活性衍生物”是天然免疫原性剂的片段或衍生物，其能在给对象施用时诱导针对所述天然免疫原性剂的免疫应答，任选地与佐剂组合。活性片段或衍生物包括或模拟至少一种“表位”或“抗原本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：A·罗桑德，M·普林格尔，
申请(专利权)人：A·罗桑德，M·普林格尔，
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