一种花生籽仁的石蜡切片方法技术

本发明专利技术提供一种花生籽仁的石蜡切片方法，其包括以下步骤：1）取材；2）5%~10%戊二醛固定；3）脱水：80%乙醇50min，95%乙醇45min，100%乙醇45min，每梯度重复1次；4）透明：体积比1:1二甲苯：100%乙醇20~30min，二甲苯15~25min，二甲苯15~25min；5）直接透蜡法透蜡，包埋，切片；6）脱蜡，复水，苏木素-曙红复染，脱水，透明，封片。本发明专利技术能较好的固定花生籽仁细胞组织，切片完整、连续、不存在空洞，切片厚度可达7?m，且操作简单，适用于所有花生品种，便于推广应用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及石蜡切片
，具体地说，是。
技术介绍
花生籽仁是花生收获的主要目标产物，决定着花生产量和品质的形成，但花生籽仁在生长过程中容易受到黄曲霉等病菌的侵染。研究表明，花生种皮的低渗透性、强韧性及耐破损等特征使花生对病害、虫害具被动抵制作用，因此花生种皮的完整性、强度对花生抗黄曲霉侵染等具有重要的屏障作用。花生种皮结构是评价花生种质抗、感黄曲霉侵染能力的重要指标，普通显微观察表明抗病品种的种皮结构存在较大差异，抗病品种的种皮细胞壁较厚，表皮细胞间结合紧密，栅栏细胞层严密厚实，裂缝和气孔较少；感病品种的种皮细胞壁则相对较薄，细胞间结合较疏松，裂缝和气孔较大，种皮具有较厚蜡质层。但是由于花生籽仁油分和蛋白质含量高，制作普通切片时，存在粘刀、薄厚不均、不连续或不完整等问题，很难得到理想的切片。石蜡切片法由于操作简单、价格低廉、可连续制片等特点，一直是观察细胞组织的形态结构及其动态变化的理想生物学研究技术。石蜡切片制作过程包括固定、脱水、透明、 透蜡、包埋、切片、贴片、脱蜡、染色、透明以及封片等步骤，在生物学的许多领域都得到了广泛的应用。但是由于花生籽仁油分和蛋白质含量非常高，其石蜡切片的效果一直不尽人意。 因此为便于观察花生细胞组织结构及动态变化，深入分析黄曲霉侵染花生的细胞学机理，明确抗、感黄曲霉花生种质的细胞学差异，筛选抗黄曲霉花生种质用于生产实践， 亟需一种可获得理想切片的花生籽仁的石蜡切片方法，但是目前关于这类该切片方法尚未见报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术中的不足，提供。为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案是，包括以下步骤I)取材；2)固定采用体积浓度为5°/Γ Ο%戊二醛固定；3)脱水80%乙醇50min,95%乙醇45min, 100%乙醇45min,每梯度至少2次脱水过程；4)透明体积比1:1 二甲苯100%乙醇处理20 30min，二甲苯处理15 25min，二甲苯处理15 25min ；5)透蜡、包埋和切片采用熔点为54 56°C的切片石蜡的直接透蜡2次，每次 1.5 2h，透蜡后包埋，切片；6)脱腊、染色和封片脱蜡二甲苯3(T40min，重复I次；复水100%乙醇2 3min,重复I次；95%乙醇2 3min,重复I次；80%乙醇2 3min, 重复I次；50%乙醇2 3min ;蒸懼水2 3min ；复染苏木素染液6 8min,蒸懼水冲洗5 7min,曙红染液染色3minl5s 4min ；脱水95%乙醇2 3min，重复I次，100%乙醇2 3min，重复I次；透明二甲苯2 3min，重复3次；封片。优选的，所述的花生籽仁的石蜡切片方法包括以下步骤I)取材；2)固定采用体积浓度为5%戊二醛固定；3)脱水80%乙醇50min,95%乙醇45min, 100%乙醇45min,每梯度至少2次脱水过程；4)透明体积比1:1 二甲苯100%乙醇处理20min, 二甲苯处理15min, 二甲苯处理 15min ；5)透蜡、包埋和切片采用熔点为54 56°C的切片石蜡直接透蜡2次，每次I. 5h， 透蜡后包埋，切片；6)脱蜡、染色和封片脱蜡二甲苯30min，重复I次；复水100%乙醇2min,重复I次；95%乙醇2min,重复I次；80%乙醇2min,重复I 次；50%乙醇2min ;蒸懼水2min ；复染苏木素染液6min,蒸懼水冲洗5min,曙红染液染色3minl5s ；脱水95%乙醇2min，重复I次，100%乙醇2min，重复I次；透明二甲苯2min，重复3次；封片。所述的苏木素染液为每升蒸馏水中含有苏木素lg、碘酸钠O. 2g、钾明矾90g、柠檬酸lg、水合氯醒50g。所述的曙红染液由以下物质组成质量分数为1%的曙红Y水溶液、95%乙醇和冰醋酸，其体积比依次为100:780:4。本专利技术的改进之处具体如下I、固定步骤常用的单一或混合固定剂如乙醇、甲醛、醋酸、FAA以及瓦纳兴等，对于花生籽仁样品的的固定效果并不理想，在切片过程中常出现切片不连续、有空洞等现象。 本专利技术采用电镜样品固定常用的戊二醛，其体积浓度为59TlO%，取得了良好的固定效果，切片连续，破裂情况大大减少，易着色，且无空洞现象出现。为了保证固定效果，固定过程中可更换固定液3 4次，以保证戊二醛固定液的体积浓度稳定在59TlO%。2、脱水步骤花生种子由于蛋白质和脂肪含量高，脱水很难彻底，导致石蜡难以全面渗透。因此，本专利技术适当延长了脱水时间，具体是80%乙醇50min，95%乙醇45min，100% 乙醇45min，每步骤重复一次，可保证脱水效果。3、透明步骤蛋白质对水分有很强的亲和力，而花生籽仁中蛋白质含量极其丰富， 导致脱水剂很难置换出来。为此，本专利技术采用了体积比1:1的二甲苯乙醇过度方法，具体透明过程如下11 二甲苯100%乙醇20 30min，二甲苯15 25min，二甲苯15 25min。44、透蜡步骤由于花生蛋白质含量高，为避免其吸涨作用，本专利技术采用了直接透蜡法。同时，由于花生籽仁中的蛋白质和脂肪对石蜡渗入的阻挡作用很强，本专利技术适当延长了透蜡时间，所用石蜡为熔点54 56°C的切片石蜡，达到了很好的效果，透蜡完全，切片完整。5、染色步骤由于戊二醛固定液会使切片染色浅，分色不明显，因此，复水后的切片采用了苏木素_曙红复染，并适当延长了染色时间，结果表明，戊二醛固定液对染色没有明显的影响，切片染色效果良好，染色深度合适，分色明显。总之，本专利技术具备以下优点I、本专利技术能较好的固定花生籽仁细胞组织，克服了普通显微观察中由于花生籽仁油分和蛋白质含量过高导致的切片粘刀、薄厚不均、不连续或不完整等缺点。2、本专利技术克服了花生籽仁石蜡切片过程中存在的切片不完整、不连续、存在空洞等技术问题，切片厚度可达7 μ m。3、本专利技术方法操作简单，适用于所有花生品种，便于推广应用。附图说明附图I是实施例I制作的抗黄曲霉侵染的Jll和感黄曲霉侵染的金花1012花生籽仁石蜡切片的显微图。附图2是实施例I和对比例分别制作的抗黄曲霉侵染的Jll的花生籽仁石蜡切片显微图。具体实施方式下面结合附图对本专利技术提供的具体实施方式作详细说明。本文中，所述的乙醇溶液，其浓度均指体积浓度，如“80%乙醇”即体积分数为80% 的乙醇溶液。实施例II、取材取黄曲霉侵染后8d (天)的抗、感花生品种Jll和金花1012的花生籽仁， 分开两片子叶，再横切。2、固定采用电镜样品固定常用的戊二醛，戊二醛的体积浓度为5%，以双蒸水作为溶剂，将花生籽仁切片放入固定剂中，固定过程中更换固定液3次。3、脱水样品采用乙醇脱水，具体脱水程序为80%乙醇50min，95%乙醇45min， 100%乙醇45min，每梯度2次脱水过程，样品脱水前用54 56°C的切片石蜡将样品包埋定位， 方便以后的操作。4、透明采用1:1 (体积比)的二甲苯乙醇过度方法，具体透明过程如下1:1 二甲苯:100% 乙醇 20min, 二甲苯 15min, 二甲苯 15min。5、透蜡、包埋和切片透蜡采用熔点为54 56°C的切片石蜡，透蜡程序如下透蜡2 次，每次I. 5h，透蜡后由包埋机完成包埋，仍为54 56°C的切片石蜡；采用普通生物切片机切片，切片厚度为7 μ m ;用恒温水浴本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种花生籽仁的石蜡切片方法，其特征在于，包括以下步骤：1）取材；2）固定：采用体积浓度为5%~10%戊二醛固定；3）脱水：80%乙醇50min，95%乙醇45min，100%乙醇45min，每梯度至少2次脱水过程；4）透明：体积比1:1二甲苯:100%乙醇处理20~30min，二甲苯处理15~25min，二甲苯处理15~25min；5）透蜡、包埋和切片：采用熔点为54~56℃的切片石蜡直接透蜡2次，每次1.5~2h，透蜡后包埋、切片；6）脱蜡、染色和封片：脱蜡：二甲苯30~40min，重复1次；复水：100%乙醇2~3min，重复1次；95%乙醇2~3min，重复1次；80%乙醇2~3min，重复1次；50%乙醇2~3min；蒸馏水2~3min；复染：苏木素染液6~8min，蒸馏水冲洗5~7min，曙红染液染色3min15s~4min；脱水：95%乙醇2~3min，重复1次，100%乙醇2~3min，重复1次；透明：二甲苯2~3min，重复3次；封片。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：单世华，闫彩霞，李春娟，张廷婷，许婷婷，
申请(专利权)人：山东省花生研究所，
类型：发明
国别省市：