微米级生物材料石蜡切片方法技术

本发明专利技术属于生物技术领域，具体涉及一种微米级生物材料石蜡切片的方法。该方法首先是将微米级生物材料固定，固定方法是将微米级生物材料悬浮于血清中，得微米级生物材料与血清混合物，再将所得的微米级生物材料与血清混合物缓慢注入Bouin固定液中，得到包裹微米级生物材料的沉淀物，然后将所得的沉淀物经过脱水处理得预处理物，所得的预处理物进行常规石蜡包埋和切片。本发明专利技术的微米级生物材料的石蜡切片方法，能简单有效的固定微米级生物材料，克服了以往的微米级生物材料切片时材料易变形，切片不连续，或存在空洞，导致无法切片或切片不完整的缺陷，切片厚度可达5um。本发明专利技术的方法操作简单，不需要专门设备，试剂易得，便于推广应用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，具体涉及一种微米级生物材料石蜡切片的方法。
技术介绍
石蜡切片是组织学常规制片技术中最为广泛应用的方法，其具有操作简单、价格低廉的特点，石蜡切片不仅用于观察正常细胞组织的形态结构，也是病理学和法医学等学科用以研宄、观察及判断细胞组织的形态变化的主要方法，而且也已相当广泛地用于其他许多学科领域的研宄中。活的细胞或组织多为无色透明，各种组织间和细胞内各种结构之间均缺乏反差，在一般光镜下不易清楚区别出；组织离开机体后很快就会死亡和产生组织腐败，失去原有正常结构，因此，组织要经固定、石蜡包埋、切片及染色等步骤以免细胞组织死亡，而能清晰辨认其形态结构。因此，石蜡切片法包括取材、固定、洗涤和脱水、透明、浸蜡、包埋、切片与粘片、脱蜡、染色、脱水、透明、封片等步骤。石蜡切片的固定步骤，一般是采用适当的化学药液一一固定液浸渍切成小块的新鲜材料，迅速凝固或沉淀细胞和组织中的物质成分、终止细胞的一切代谢过程、防止细胞自溶或组织变化，尽可能保持其活体时的结构。固定也能使组织硬化，有利于切片的进行，而且也有媒浸作用，有利于组织着色。常用的混合固定液有Bouin氏液、Zenker氏液、FAA液、Carnoy氏液、SuSa液等。但在生物领域研宄中，切片通常会遇到肉眼无法看见的、微米级的生物材料，例如细胞团、植入前的动物胚胎等，采用常用的固定剂对材料的固定效果不理想，切片时材料易变形，切片不连续，或存在空洞，导致无法切片或切片不完整，目前，一直没有较理想的，研宄者们只能采用费用、设备都要求较高的电镜观察方法，限制了对微米级生物材料的研宄。【专利技术内容】有鉴于此，本专利技术的目的首先在于提供一种微米级生物材料的固定方法，该方法能简单有效的固定微米级生物材料；本专利技术的目的之二在于提供一种，微米级生物材料采用上述的固定方法固定之后，利于后续的切片操作；本专利技术的目的之二在于提供一种小鼠植入前胚胎的石蜡切片方法，由该方法得到的切片质量好，克服了现有技术存在的缺陷。为实现上述目的，本专利技术的技术方案为:微米级生物材料的固定方法，将微米级生物材料悬浮于血清中，得微米级生物材料与血清混合物，再将所得的微米级生物材料与血清混合物缓慢注入Bouin固定液中，得到包裹微米级生物材料的沉淀物。所述的微米级生物材料的固定方法，所述Bouin固定液为苦味酸饱和液、甲醛和冰醋酸的混合液，所述苦味酸饱和液、甲醛和冰醋酸的体积比为75:25:5 ;所述苦味酸饱和液浓度为0.015g/ml，具体是将1.5g苦味酸固体溶解在10ml蒸馏水中，65°C水浴使其充分溶解，使用时40°C温浴Bouin固定液。因此，本专利技术还进一步提供了 Bouin固定液与血清组合在石蜡切片材料固定中的应用。，包括如下进行的步骤:(I)将微米级生物材料悬浮于血清中，得微米级生物材料与血清混合物，再将所得的微米级生物材料与血清混合物缓慢注入Bouin固定液中，得到包裹微米级生物材料的沉淀物；(2)将步骤(I)所得的沉淀物依次经过50%乙醇水溶液处理、70%乙醇水溶液处理、90 %的乙醇水溶液处理、无水乙醇处理、二甲苯与乙醇的混合液处理、二甲苯处理及二甲苯与石蜡的混合液处理，得预处理物；所述二甲苯与乙醇的混合液中二甲苯与乙醇的体积比为1:1 ;所述二甲苯与石蜡的混合液中二甲苯与石蜡的体积为1:1 ;(3)将步骤(2)所得的预处理物进行常规石蜡包埋和切片。进一步，所述的，所述步骤(I)中，所述包裹微米级生物材料的沉淀物为凝结成直径为l_2mm的块状沉淀物。进一步，所述的，所述步骤(2)中，50%乙醇水溶液处理8-15min，70%乙醇水溶液处理8_15min，90%的乙醇水溶液处理8_15min，无水乙醇处理25_35min，二甲苯与乙醇的混合液处理25_35min，二甲苯处理8_15min，二甲苯与石錯的混合液处理2.5-3.5h。优选的，所述的，所述步骤(2)中，50%乙醇水溶液处理10min，70%乙醇水溶液处理lOmin，90 %的乙醇水溶液处理lOmin，无水乙醇处理30min，二甲苯与乙醇的混合液处理30min，二甲苯处理lOmin，二甲苯与石錯的混合液处理3h。本专利技术还具体的提供了一种小鼠植入前胚胎的石蜡切片方法，包括如下进行的步骤:(I)取小鼠植入前胚胎，用PBS缓冲液洗涤，除去组织碎片及红细胞杂质，得待切片组织；(2)将步骤(I)所得的待切片组织分散并悬浮于血清中，得小鼠胚胎与血清混合物，吸取含有一个或多个小鼠胚胎的所述混合物缓慢注入Bouin固定液中，得到包裹小鼠胚胎的沉淀物；(3)将步骤(2)所得的沉淀物依次经过50%乙醇水溶液处理8-15min、70%乙醇水溶液处理8-15min、90 %的乙醇水溶液处理8_15min、无水乙醇处理25_35min、二甲苯与乙醇的混合液处理25_35min、二甲苯处理8_15min及二甲苯与石錯的混合液处理2.5-3.5h，得预处理物；所述二甲苯与乙醇的混合液中二甲苯与乙醇的体积比为1:1 ;所述二甲苯与石蜡的混合液中二甲苯与石蜡的体积为1:1 ;(4)将步骤(3)所得的预处理物进行常规石蜡包埋和切片。进一步，所述的小鼠植入前胚胎的石蜡切片方法，所述步骤(2)中，所述血清优选为胎牛血清。本专利技术的有益效果:(I)本专利技术的微米级生物材料的固定方法，该方法能简单有效的固定微米级生物材料，不需特殊的试剂及仪器，解决了现有技术中对微米级生物材料的固定效果不理想的冋题。(2)本专利技术的微米级生物材料的石蜡切片方法，采用本专利技术的微米级生物材料的固定方法固定材料，克服了以往的微米级生物材料切片时材料易变形，切片不连续，或存在空洞，导致无法切片或切片不完整的缺陷，切片厚度可达5um。(3)本专利技术的方法操作简单，不需要专门设备，试剂易得，便于推广应用。【附图说明】图1实施例1中所采用的口径为100-150um的玻璃毛细血管的制备；其中A为口径Imm的原装毛细管；B为在酒精灯上拉细；C为制备好的备用的口径为100_150um的毛细管。图2采用微旋移液器移取小鼠胚胎及小鼠胚胎的固定；其中A为微旋移液器装配拉细的毛细管为在显微镜下向Bouin液中注入小鼠胚胎与血清混合物；C为胚胎被包裹在黄色沉淀物中。图3固定包埋前的2-细胞、4-细胞期小鼠胚胎。图4未进行脱蜡处理的胚胎石蜡切片(5 μ m);其中A为2-细胞胚胎；B为4_细胞胚胎。图5 HE染色后的小鼠植入前胚胎切片；A为I个4-细胞胚胎，显示2个卵裂球的细胞核为3个囊胚，显示明显的囊胚腔、内细胞团和滋养层细胞。【具体实施方式】下面结合具体实施例来进一步描述本专利技术，本专利技术的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本专利技术的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本专利技术的精神和范围下可以对本专利技术技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本专利技术的保护范围内。以下实施例中，以小鼠植入前胚胎为例，具体阐述本专利技术的，其中所需的仪器与试剂如下:试剂:Bouin固定液，胎牛血清，石錯，无水乙醇，二甲苯。当前第1页1 2 本文档来自技高网...

【技术保护点】
微米级生物材料的固定方法，其特征在于，将微米级生物材料悬浮于血清中，得微米级生物材料与血清混合物，再将所得的微米级生物材料与血清混合物缓慢注入Bouin固定液中，得到包裹微米级生物材料的沉淀物。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：谭冬梅，谭毅，张倩，杨根岭，赖国旗，潘永全，
申请(专利权)人：重庆医科大学，
类型：发明
国别省市：重庆;85