检测调钙素水平的ELISA试剂盒及方法技术

本发明专利技术“检测调钙素水平的ELISA试剂盒及方法”，涉及医学检测试剂。特别涉及抗调钙素蛋白的单克隆抗体及分泌该抗体的杂交瘤细胞：CGMCC?No.6509。基于该单克隆抗体与酶联免疫反应原理建立起来的检测调钙素水平的ELISA试剂盒及方法。利用本发明专利技术的试剂盒可以检测血清中调钙素水平，探索调钙素对于肝损伤的临床意义，以及调钙素与肝损伤其他各血清学指标之间的相关性，以期能够更好地帮助我们明确肝脏炎症损伤的程度，从而对肝病患者的炎症损伤作出明确诊断。

【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及医学检测试剂，特别是一种检测肝损伤患者血清中调钙素水平的ELISA试剂盒及方法。
技术介绍
肝炎是严重威胁我国广大人民群众健康的最主要传染病之一。肝炎是各种原因损伤肝脏的共同后果，尤以各种病毒性感染、药物性损伤、酒精性损伤等因素多见。在我国，肝脏炎症又以HBV感染所致炎症为主。HBV和HCV感染所致的肝衰竭、肝硬化和原发性肝细胞癌，是重要的疾病死亡原因之一。目前，临床上广泛应用的肝脏炎症血清学指标主要是谷丙转氨酶(ALT)和谷草转 氨酶(AST)。然而，在长期的临床实践中，医生发现血清转氨酶水平与肝脏炎症程度常常不一致，具有很大的局限性。临床医生常需要对患者进行肝活检病理组织学检查，来确定肝脏炎症的真实情况。肝活检是确诊肝脏炎性损伤性质和程度的金标准，但其为创伤性检查，价格昂贵，患者不愿接受，并且由于难以重复进行，不适合作为诊断和疗效判断的常规手段。因此，临床上迫切需要其他更灵敏准确的血清学指标来进行辅助诊断，弥补转氨酶的不足。1978年，Yamaguchi等人发现在肝脏组织中存在一种钙离子结合蛋白，通过调节细胞内的Ca2+信号传导物来调节肝细胞的功能，命名为调钙素(regucalcin)。1992年，Fujita等人用二维电泳的方法检测大鼠肝可溶性蛋白与年龄的关系时发现了一种新的蛋白，其表达可以独立减少衰老细胞中雄激素的合成，其分子量在30KD左右，故命名为衰老标志蛋白 30(Senescence Marker Protein-30, SMP30)。1993 年，Shimokawa N和 Yamaguchi报道了一种编码蛋白质的cDNA，证实调钙素与SMP30为同一种蛋白。在生理情况下，调钙素mRNA主要在肝脏细胞和肾皮质细胞中大量表达，在心脏、脑、骨骼和一些其他组织细胞中也有少量表达。在肝脏，调钙素大量存在于肝细胞胞浆，占肝脏可溶性蛋白总量的2%。调钙素可以在多种组织细胞的胞浆和胞核发挥重要生理作用。除了调节细胞内钙稳态，还具有抑制蛋白酪氨酸磷酸酶、蛋白丝氨酸和(或)苏氨酸磷酸酶的作用，从而影响蛋白质磷酸化、去磷酸化这一重要的修饰过程。此外，调钙素还具有抑制细胞增殖的作用。2010年，Chakraborti首次测定了调钙素的晶体结构，证实人类调钙素蛋白的一级晶体结构上只有一个金属离子结合位点，可以结合二价离子包括Zn2+、Ca2+、Mn2+或Mg2+，该晶体结构本身更倾向于结合Zn2+，增强酶活性；在外界作用条件下，调钙素蛋白可能会结合更多Ca2+从而促进钙聚集。调钙素基因及其蛋白质表达异常参与了多种疾病的发病过程，如高血压病、肾脏病等。由于调钙素能够释放入血，其血清学水平可能在一定程度上反映肝组织的损伤。但具体如何反映尚不清楚，血清中调钙素水平的变化与肝组织学表达的关系还需要进一步研究。临床上广泛应用的肝脏炎症血清学指标主要是谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)，它们也是判断疗效的主要指标。此外，对于HBV感染者，ALT和AST同时也是最常用的抗病毒治疗的指征。然而，在长期的临床实践中，医生发现血清转氨酶水平与肝脏炎症程度常常不一致。在转氨酶正常的慢性无症状HBV感染者中，肝组织完全正常的仅占极少数，大约90%左右的感染者有不同程度的肝组织炎症及纤维化。在重型肝炎患者中，常常出现“酶胆分离”现象，即总胆红素越来越高，而ALT和AST则趋于下降，因此转氨酶更不能准确反映重型肝炎肝损伤的程度。综上所述，ALT和AST作为目前主要的肝脏炎症指标，其意义具有很大的局限性。基于这一点共识，临床医生常常需要对患者进行肝活检病理组织学检查，来确定肝脏炎症的真实情况。肝活检是确诊肝脏炎性损伤性质和程度的金标准，但其为创伤性检查，价格昂贵，患者不愿接受，并且由于难以重复进行，不适合作为诊断和疗效判断的常规手段。因此，临床上迫切需要其他更灵敏准确的血清学指标来进行辅助诊断，弥补转氨酶的不足。调钙素在反应肝细胞损伤方面具有一定的临床意义，但是由于国内外尚没有检测血清调钙素的试剂盒，极大地限制了对其临床意义的研究。目前有关该标志物与肝细胞损伤之间的关系仍然缺乏系统的对照研究，其表达水平与肝脏组织学的炎症程度相关性研究也极少，对重型肝炎的一项研究仅进行了 4例血清学WB检测。显然，评价调钙素的临床意 义急需标准规范的试剂盒。为此，我们初步设计此实验试图寻找到一种ELISA检测方法，并通过此法检测血清中调钙素水平，探索调钙素对于肝损伤的临床意义，以及调钙素与肝损伤其他各血清学指标之间的相关性，以期能够更好地帮助我们明确肝脏炎症损伤的程度，从而对肝病患者的炎症损伤作出明确诊断。
技术实现思路
本专利技术基于上述领域的需求，提供一种用于检测血清中调钙素水平的方法及试剂盒，该方法及试剂盒检测调钙素灵敏且特异，为本领域研究人员对调钙素与肝损伤之间关系的研究提供了便利的工具和方法。分泌抗调钙素蛋白18号单克隆抗体的小鼠杂交瘤细胞DC091，保藏号为CGMCCNo. 6509。抗调钙素蛋白的18号单克隆抗体，其特征在于由小鼠杂交瘤细胞DC091分泌。一种检测调钙素水平的ELISA试剂盒，包括酶标板，其特征在于所述酶标板微孔内包被有含上述18号单克隆抗体的包被液。包被液中所述18号单克隆抗体的浓度为5ug/ml。所述ELISA试剂盒还包括封闭液、酶标二抗、底物显色液、终止液。一种检测调钙素水平的ELISA方法，其特征在于，酶联免疫反应中的第一抗体为上述18号单克隆抗体。所述ELISA方法中，酶标二抗的工作稀释倍数为I :20000。所述第一抗体制备成为包被液包被于酶标板的微孔中，所述包被液中18号单克隆抗体的浓度为5ug/ml。本专利技术中，专利技术人获得了分泌抗抗调钙素蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株。基于该单克隆抗体以及双夹心酶联免疫反应原理，专利技术人进一步提供了一种检测肝损伤患者血清的调钙素水平的方法和试剂盒。试验数据表明，该单克隆抗体用于检测调钙素，灵敏度可达到Pg / ml的水平，与其它蛋白无交叉反应，可用于特异性检测调钙素。本专利技术基于同样的原理和获得的单克隆抗体，还提供了检测调钙素水平的试剂盒，试剂盒的主要组成组件为酶标板，酶标板上包被有本专利技术获得的18号单克隆抗体。生物保藏信息保藏号CGMCCNo. 6509 生物材料名称小鼠杂交瘤细胞DC091保藏日期2012年9月6日保藏机构中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号附图说明图I.不同调钙素浓度与OD值相关性。纵坐标为OD值，横坐标为调钙素浓度，单位pg/ml。具体实施例方式下面通过具体试验数据说明本专利技术的技术方案。实施例I调钙素抗体的制备和验证I. I单克隆抗体的制备小鼠杂交瘤细胞DC091是经过选择性培养、筛选以及鉴定后的能够分泌特异性抗体对抗天然调钙素蛋白的杂交瘤细胞株。选用小鼠腹腔接种法，即将杂交瘤细胞接种至小鼠腹腔，在杂交瘤细胞生长的同时渗出大量腹水，腹水中便含有抗体。具体操作过程如下选取BALb-C小鼠进行腹腔注射石蜡油诱导，O. 5ml/只；10_14天后，将杂交瘤细胞培养至5X IO5 IO6个细胞/毫升，在小鼠腹腔进行杂交瘤接种，O. 5ml/只；10-14天后小鼠腹腔有腹水渗出，根据鼠的健康状况可一次杀鼠取腹水，本文档来自技高网...

【技术保护点】
分泌抗调钙素蛋白18号单克隆抗体的小鼠杂交瘤细胞DC091，保藏号为CGMCC？No.6509。

【技术特征摘要】
1.分泌抗调钙素蛋白18号单克隆抗体的小鼠杂交瘤细胞DC091，保藏号为CGMCCNo. 6509。2.抗调钙素蛋白的18号单克隆抗体，其特征在于由权利要求I所述杂交瘤细胞分泌。3.含有权利要求2所述的18号单克隆抗体的溶液。4.一种检测调钙素水平的ELISA试剂盒，包括酶标板，其特征在于所述酶标板微孔内包被有权利要求2所述的18号单克隆抗体。5.根据权利要求4所述的ELISA试剂盒，其特征在于包被的所述18号单克隆抗体溶于包被液中，浓度为5ug/ml。6.根...

【专利技术属性】
技术研发人员：张晶，李莉，谢立，赵鹏，韦新焕，
申请(专利权)人：首都医科大学附属北京佑安医院，
类型：发明
国别省市：