一种检测急性心梗的试纸、试纸制备及应用方法技术

本发明专利技术提供了一种检测急性心梗的试纸、试纸制备及应用方法，试纸包括底板、附着在底板上依次紧密相连的样品吸收垫、结合垫、层析膜和吸水垫；其中，结合垫包被有葡聚糖-抗体-荧光素混合标记物；层析膜上具有一条检测带和一条质控带，检测带上固定有单克隆抗体；质控带固定有能与葡聚糖-抗体-荧光素混合标记物特异结合的兔抗鼠IgG抗体，本发明专利技术试剂的敏感范围达到0.1ng/mL，并且可实现心肌梗塞病人血清中微量肌红蛋白、肌钙蛋白I和肌酸激酶同工酶定量检测，点样后3-5分钟即可得到结果，操作简便，不需要专业人员操作。

【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及免疫诊断试剂领域，具体为涉及一种检测急性心梗的试纸、试纸制备及应用方法。
技术介绍
随着我国人口老龄化进程的加剧，急性心肌梗塞已成为危害中国的重大疾病。世界卫生组织指出全球每年有850万人死于急性心肌梗塞。在我国，急性心肌梗塞每年患者为2千万人，而有100万人被急性心肌梗塞夺去生命。因而急性心肌梗塞已经成为危害国人健康的重大疾病。治疗显示，急性心肌梗塞发病后3小时内是治疗的至关重要时间。只有对心肌梗塞患者进行早预防、早发现、早救治，才能最大程度挽救患者生命，最大程度改善患者预后。 寻找早期心肌损伤标志物是早期诊断心肌梗塞的关键。目前研究表明人肌红蛋白、肌酸激酶同工酶、肌钙蛋白I可以疾病发作后可释放到外周血，可作为心肌梗塞诊断的特异性指标。目前，国内检测心肌梗塞主要免疫学方法有酶联免疫吸附试验法(ELISA)和金标免疫试纸条。酶联免疫吸附试验法涉及加样、温浴、洗涤、显色、终止等多个步骤，至少需要3小时，另外，需要在检验科或中心实验室完成，因而不可能在急性心肌梗塞发病后病人家庭，急救车展开。另外酶联免疫吸附试验法灵敏度只能达到10ng/ml，如果要对10ng/ml以下的物质进行检测，就会产生假阴性的结果，即漏检。免疫胶体金技术是以胶体金作为示踪标志物的一种的免疫技术。相比之下，胶体金技术的敏感性比酶联免疫吸附试验法更差，只能达到50ng/ml，要对人肌红蛋白、肌钙蛋白I、肌酸激酶同工酶的微量检测几乎是不可能的，另外目前国内胶体金技术尚属于起步阶段，基本上不能对上述指标的定量。鉴于以上特征，目前国内乃至世界在诊断急性心肌梗塞上迫切需要建立一个能够及时、高敏感性、定量检测系统，并将上述检测系统用于急性心肌梗塞产品的开发。
技术实现思路
针对现有技术的上述缺陷和问题，本专利技术实施例的目的是提供能用于检测急性心梗的一种检测急性心梗的试纸、试纸制备及应用方法。为了达到上述目的，本专利技术实施例提供如下技术方案一种检测急性心梗的试纸，包括底板、附着在底板上依次紧密相连的样品吸收垫、结合垫、层析膜和吸水垫；其中，结合垫包被有葡聚糖-抗体-荧光素混合标记物；层析膜上具有一条检测带和一条质控带，检测带上固定有单克隆抗体；质控带固定有能与葡聚糖-抗体-荧光素混合标记物特异结合的兔抗鼠IgG抗体。本专利技术还提供一种检测急性心梗的试纸制备方法，包含以下步骤(I)用稀释液将葡聚糖-抗体-荧光素混合标记物稀释到浓度至O. 01-0. 03mg/ml范围内，然后将结合垫浸泡在稀释液中，经过烘干或者真空冷冻干燥后，再装配到试纸条底板上；稀释液的组成为pH7.4 O. OlM的PBS缓冲液中加入质量百分比O. 1% NaN3、质量百分比 1% BSA。(2)在层析膜上设置两条带，一条检测带和一条质控带；检测带上固定单克隆抗体，所述克隆抗体为抗肌红蛋白、肌钙蛋白I和肌酸激酶同工酶单克隆抗体的一种；质控带固定兔抗鼠IgG抗体；(3)在步骤(2)的层析膜的一侧贴上样品吸收垫和结合垫，另一侧贴上吸水垫；样品吸收垫、结合垫、层析膜的检测带、层析膜的质控带和吸水垫依次排布。本专利技术还提供一种检测急性心梗的试纸应用方法，包含以下步骤(I)在样品吸收垫上加入待测血清样品；在毛细作用下，样品液向吸水垫一端泳动，在结合垫处与葡聚糖-抗体-荧光素混合标记物形成免疫复合物，再进一步泳动，免疫 复合物与检测带处的单克隆抗体结合形成类似双抗体夹心的免疫复合物，剩余的荧光标记抗体移动至控制线反应形成条带，为阳性结果；(2)通过荧光检测装置检测；(3)结果的判断检测带不显示，质控带显示条带，表明试纸条有效，待测样品不含所测抗原；检测带显示条带，质控带显示条带，表明待测样品含有所测抗原；检测带不显示，质控带不显示，表明试纸条无效；检测带显示条带，质控带不显示，表明试纸条无效。本专利技术将葡聚糖-抗体-突光素混合标记的信号放大系统技术与传统免疫层析技术相结合，开发一种具有高灵敏度的荧光定量试纸用于诊断急性心肌梗塞。本荧光定量试纸通过荧光强度变化来反应样品中的抗原含量，可实现抗原的特异定量检测。这对于心肌梗塞的早期诊断、心肌梗塞的严重程度评估、治疗方案选择和预后判断具有重要的意义。同时本荧光试纸中的葡聚糖-抗体-荧光素混合标记的信号放大系统技术能够将灵敏度提高至O. lng/ml，这对于检测血清中微量物质是极重要的。另外，此高灵敏度荧光定量诊断试纸3-5分钟内即可观察结果，标本用量少，可检测人血清/血浆中人肌红蛋白、人肌钙蛋白I及人肌酸激酶同工酶三项指标，这对于早期诊断心肌梗塞是极重要的。本专利技术产品为临床诊断心肌梗塞提供了敏感、特异、快捷的新手段。本专利技术相对于现有技术具有如下的优点及效果(I)特异性，利用抗原与抗体特异反应原理检测人肌红蛋白、肌钙蛋白I和肌酸激酶同工酶，其相对特异性可分别达到96. 6%, 97. 0%, 98. 0% ；(2)敏感性，采用葡聚糖-抗体-荧光素混合标记技术信号放大技术，可将诊断试剂的敏感范围从lO-lOOng/mL推进到O. Ing/mL,即敏感性提高了 100-1000倍,并且可实现心肌梗塞病人血清中微量肌红蛋白、肌钙蛋白I和肌酸激酶同工酶定量检测；(3)快速性，本专利技术开发产品点样后3-5分钟即可得到结果；(4)简便性，本专利技术开发产品操作简便，不需要专业人员操作。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些图获得其他的图。图I是本专利技术所提供的试纸条的结果判读示意图，其中T为检测带，C为质控带。图2是本专利技术提供的试纸条的结构示意图，其中1为样品吸收垫，2为结合垫，3为层析膜，4为底板,5为吸水垫。具体实施例方式下面将结合本专利技术的图，对本专利技术的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。本专利技术的原理是本专利技术所涉及的检测方法是双抗体夹心法，一个是包被抗体，一个是标记抗体，对血清中的抗原进行检测，常规抗体标记采用辣根过氧化物酶标记抗体，但是辣根过氧化物酶标记存在敏感性差的问题。荧光素标记抗体技术，可极大提高检测试剂的敏感性。就标记抗体而言，常规的荧光素标记只有少量荧光素分子，与单位抗体结合，因 而其阳性信号/背景信号之间的读数比值过低。本专利技术特别使用葡聚糖-抗体-荧光素混合标记技术。基于每个葡聚糖分子能含有1000个divinyls μ Ifone (二乙烯砜)活性基团，除少部分的divinylsy Ifone活性基团自身偶联之外，形成类似口罩的结构，每个葡聚糖分子中绝大部分的divinyls μ Ifone活性基团可与荧光素或抗体分别进行偶联。因此，先将葡聚糖活化与成百上千的荧光素分子结合，结合后的葡聚糖一荧光素混合物再与抗体结合，利用这种技术阳性信号/背景信号之间的读数比值成百上千的提高。本专利技术所提供的荧光免疫试纸，原理包括双抗体夹心法和间接法两种免疫学方法。双抗体夹心法是检测带的反应方法本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测急性心梗的试纸，其特征在于：包括底板、附着在底板上依次紧密相连的样品吸收垫、结合垫、层析膜和吸水垫；其中，结合垫包被有葡聚糖？抗体？荧光素混合标记物；层析膜上具有一条检测带和一条质控带，检测带上固定有单克隆抗体；质控带固定有能与葡聚糖？抗体？荧光素混合标记物特异结合的兔抗鼠IgG抗体。

【技术特征摘要】
1.一种检测急性心梗的试纸，其特征在于包括底板、附着在底板上依次紧密相连的样品吸收垫、结合垫、层析膜和吸水垫；其中，结合垫包被有葡聚糖-抗体-荧光素混合标记物；层析膜上具有一条检测带和一条质控带，检测带上固定有单克隆抗体；质控带固定有能与葡聚糖-抗体-荧光素混合标记物特异结合的兔抗鼠IgG抗体。2.根据权利要求I所述的一种检测急性心梗的试纸，其特征在于所述单克隆抗体为抗肌红蛋白、肌钙蛋白I和肌酸激酶同工酶之一。3.根据权利要求I所述的一种检测急性心梗的试纸，其特征在于其中所述单克隆抗体的制备步骤为 (O使用单克隆抗体免疫抗原免疫小鼠；分别以单克隆抗体抗原与等量弗氏完全佐剂乳化后，采用皮下多点注射方式对4只4周龄的雌性BALB/c小鼠进行皮下免疫；初免后加强免疫数次； (2)筛选抗单克隆抗体； A、将IXlO8脾细胞与2X107骨髓瘤细胞SP2/0混合于50mL融合管中，加DMEM培养基至30mL; IOOOrpm离心7min,将上清尽量吸净； B、在手掌上轻击融合管底部，使沉淀细胞松散均匀，置40°C水浴中预热，用ImL吸管在I分钟内加预热至40°C的50%，边加边轻轻摇动混匀，用5mL吸管在90秒内加25mL预热至370C的不完全DMEM培养基，室温静置lOmin，800rpm离心7分钟，弃上清； C、加入5M1HAT完全培养基，轻轻吹吸沉淀细胞，使其悬浮并混匀，然后补加HAT培养基至90mL，分装至融合前一天培养的含有饲养细胞的96孔细胞培养板，每孔100 μ L ;培养板置37°C 5%C02培养箱内培养； D、培养至第5天，用HT完全培养基换出孔内1/2HAT培养液，培养至第7天，用HT培养基换出孔内全部培养液； E、每天观察杂交瘤细胞生长情况，待杂交瘤细胞长至10%以上孔底面积时，吸出培养液，进行抗体检测；用竞争抑制ELISA方法，筛选出分泌抗细菌脂多糖和脂溶性蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞； (3)腹水生产，选用标准BALB/c小鼠，先用降植烷进行小鼠腹腔注射，一周后每只老鼠按照5X106杂交瘤细胞接种到小鼠腹腔中去；I周后采集腹水，将腹水置于37°C静置2小时后，13000rpm离心lOmin，除去细胞成分和其他的沉淀物，收集上清，再过玻璃纤维柱,收集到澄清的腹水； (4)抗体纯化，采用辛酸-硫酸铵法进行初步纯化，取ImL透析后粗提物加入ImL预装柱，用pH=7. 4的PBS进行洗涤，加入pH=2. 7的ImL的IOOmM甘氨酸进行洗脱，重复6次；收集流出液，ImL/管，并用50 μ I IM Tris中和反应。4.根据权利要求I所述的一种检测急性心梗的试纸，其特征在于所述的兔抗鼠IgG抗体的制备步骤为 (1)用含鼠IgG的免疫原多次免疫家兔； (2)收集、分离得到含有兔抗鼠IgG抗体的血清； (3)将抗体血清加入到亲和层析柱中纯化得到兔抗鼠IgG抗体。5.根据权利要求I所述的一种检测急性心梗的试纸，其特征在于所述的葡聚糖-抗体-荧光素混合标记物制备步骤为(1)将荧光素分子与以亲水链为骨架的葡聚糖分子反应，得到结合荧光素的葡聚糖分子; (2)将结合荧光素的葡聚糖分子与抗体反应,纯化,得到葡聚糖、抗体和荧光素混合标记物。6.根据权利要求5所述的一种检测急性心梗的试纸，其特征在于所述的葡聚糖优选为分子量20，000 30，000的葡聚糖。7.根据权利要求5所述的一种检测急性心梗的试纸，其特征在于所述的荧光素优选为异硫氰酸荧光素。8.根据权利要求5所述的一种检测急性心梗的试纸，其特征在于所述的纯化优选通过凝胶层析法进行分离纯化。9.根据权利要求I所述的一种检测急性心梗的试纸，其特征在于所述的葡聚糖-抗体-荧光素混合标记物制备步骤 (O结合荧光素的葡聚糖分子的制备用有机溶剂溶解荧光素，在磁力搅拌条件下，滴加在含葡聚糖的醋酸溶液中，避光反应，使得荧光素上的碳原子与葡聚糖上的二乙烯砜反应以便进行标记偶联；反应结束后，将PH值调至8. 8-9. 2，离心，取沉淀，得到结合荧光素的葡聚糖分子； (2)葡聚糖-抗体-荧光素混合标记物初产物的制备洗涤步骤(I)得到的沉淀，再用醋酸溶液溶解沉淀，接着将PH值调节为4. 8-5. 2 ;在磁力搅拌条件下，滴加入抗体溶液，抗体加入的量按Img荧光素加入IOOmg免疫球蛋白计算，进行反应后得到葡聚糖...

【专利技术属性】
技术研发人员：江建华，
申请(专利权)人：江建华，
类型：发明
国别省市：