一种多溴联苯同系物免疫原及其制备方法技术

本发明专利技术涉及一种多溴联苯同系物免疫原及其制备方法，将丁二酸酐、4，4’-二溴联苯溶解于二氯甲烷中，冰浴搅拌，无水三氯化铝在冰水浴条件投料，密封搅拌加稀盐酸终止反应后，经处理得到PBB28半抗原4-(4，4′-二溴联苯基)-4氧-丁酸，然后混合N-羟基琥珀酰亚胺和N，N′-二环己基碳酰亚胺，加入牛血清蛋白搅拌反应并转移到半透膜中，在磷酸盐缓冲溶液中透析后，离心分出上清液，即得PBB28人工免疫原PBB-BSA偶联物。本发明专利技术制备方法简便，成本低，容易工业化生产；多溴联苯人工免疫原PBB28-BSA通过免疫动物，可以制备对多溴联苯单体具有免疫反应特性的特异性抗体，用于现场检测水体、土壤及大气中痕量的多溴联苯单体。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种免疫原及其制备方法，尤其是涉及。
技术介绍
溴系阻燃剂是目前世界上产量最大的有机阻燃剂之一，其中主要是多溴联苯醚(PBDEs)和多溴联苯(PBBs)类物质，常作为阻燃添剂加入树脂、聚苯乙烯和聚氨酯泡沫等高分子合成材料中，广泛地应用于塑料制品、纺织品、电路板和建筑材料等领域，并随着这些产品的使用，慢慢逸散到环境中。多溴联苯和多氯联苯化学性质类似，是一种在环境中非常稳定而且容易形成生物积累的化学品，关于多溴联苯的生物毒性的认识这几年也有很大发展。由PBBs和 PBDEs蓄积作用而造成的环境、食品污染问题已引起欧盟、美国等发达国家高度关注，欧盟电子电器设备中有害物质的限制指令(ROHS)指令所涉及的有害物质包括阻燃剂(FlameRetardants)-多溴联苯(PBBs)和多溴联苯醚(PBDEs)。目前环保组织关于PBDE和PBBs的研究主要集中在水体、土壤、大气等环境领域和生物体的毒性方面，样品的前处理过程、净化过程和分析过程都存在较大的差异。因此，开展研究并建立有效、可靠的含溴阻燃剂的检测方法及标准，并通过相关的法规予以保障，成为一项极为重要和迫切的工作。免疫分析是基于抗原抗体特异性识别和结合反应为基础的分析方法。免疫分析具有特异性强、灵敏度高(检测限可达10_6 I(T9g)、方便快捷、分析容量大、分析成本低、安全可靠等优点。一般不需要贵重仪器，可大大简化甚至省去前处理过程，对使用人员的专门技术要求不高，容易普及和推广。对于多溴联苯的免疫监测方法的建立，国内迄今为止还没有见到相关的报道。这可能由于多溴联苯同系物的种类繁多，而且，PBBs同系物的物理、化学、生物和毒物学的性质不同。因此有关前沿研究要求PBBs的分析必须由测定总量的水平提高到测定同类物和异构体的水平上来，因此单个PBBs同系物的定性和定量分析是十分必要的。因此，多溴联苯同系物及其衍生物的制备对其毒理学性质，迁移转化，生态效应等研究具有重要意义。多溴联苯半抗原以及免疫原的制备是采用免疫方法测定多溴联苯的基础，对于建立多溴联苯单体的监测方法，具有重要的应用价值和理论研究意义。当前市场上销售的多溴联苯单体不多，更没有见到有关能和大分子蛋白质形成免疫原的多溴联苯半抗原衍生物分子，因此，关于多溴联苯类环境污染物的免疫检测方法的研究至今还未见报道。对于多溴联苯免疫监测方法的建立，高纯度合适的半抗原是制备具有高灵敏度和特异性免疫原和高效价抗体的根本。
技术实现思路
本专利技术的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种步骤简单，速度快，产率高的多溴联苯同系物免疫原及其制备方法。本专利技术的目的可以通过以下技术方案来实现一种多溴联苯同系物免疫原，该免疫原的结构式如下 CH2CH2CO NHBSAtoon] ijX X離柳獅胃隱航*撕，誠共振，紫外光谱等检测手段分析鉴定。一种多溴联苯同系物免疫原的制备方法，包括以下步骤(1)PBB28半抗原4_(4，4' -二溴联苯基)_4氧-丁酸的合成 制备路线如下 P Α1ΓΙ Λ 八.coch2ch2cooh Pov ￠:次αχ将丁二酸酐、4，4’ - 二溴联苯溶解于非质子性溶剂中，冰浴搅拌，无水三氯化铝在冰水浴条件下投料，在l_2h内分次加入，无水三氯化铝滴加完毕后撤去冰水浴，在常温条件下，隔水密封搅拌10-14h，薄层法监测反应原料点消失后，加稀盐酸终止反应。有机层用稀盐酸水洗并旋转蒸发除去有机溶剂，得黄色固体粉末粗品，经过重结晶，干燥，得到PBB28半抗原4-(4，4' -二溴联苯基)-4氧-丁酸；(2) PBB28人工免疫原PBB28-BSA的制备制备路线如下 ^COCHjCHjCOOH 0Λ,COCHjCHiCO-NH-BSA poc + BrBr在0-5°C的条件下，将溶有N-羟基琥珀酰亚胺和N，N' - 二环己基碳酰亚胺的有机溶液逐滴加入溶有PBB28半抗原的有机溶液中，搅拌反应6-12h，4°C过夜，将离心分出的上层活化酯加入到pH为6. 8-7. 4，溶有牛血清白蛋白(BSA)的磷酸盐缓冲溶液中，0_4°C的冰浴中反应4-6h，离心得到上清液，将上清液转移到半透膜中，在pH为6. 8-7. 4的磷酸盐缓冲溶液或O. 9%生理盐水透析5天，即得PBB28人工免疫原(PBB-BSA偶联物)，经柱提纯，加入等量甘油-20°C下或者冻干保存。步骤(I)中所述的非质子性有机溶剂为二氯甲烷或硝基苯。步骤(I)中所述的4，4’_ 二溴联苯、丁二酸酐和无水AlCl3的摩尔比为1:1-2: 1-2.5。步骤(I)采用体积比为I : I甲醇和乙醚组成的混合溶液进行重结晶。步骤(2)所述的有机溶液中采用的溶剂为N’ N- 二甲基甲酰胺或二甲基亚砜。步骤(2)所述的PBB28半抗原、N-羟基琥珀酰亚胺、N，N' - 二环己基碳酰亚胺与牛血清白蛋白的摩尔比为I : 1-4 1-4 0.005-0.05。全抗原的表征将制备的全抗原适当稀释，使其吸光度在O. 1-2之间，以PBS为空白对照，用紫外分光光度计在200 500nm分别测定二溴联苯(PBB28)，BAS，和PBB28-BSA的吸光值，绘制紫外吸收光谱图，并根据以下公式计算偶联比 c半抗原/M半抗原偶联结合比=- C蛋白质/M蛋白质与现有技术相比，本专利技术具有以下优点 (I)采用一步反应，根据原料多溴联苯上的溴原子的位置在苯环上引入含有4个碳原子的羧基官能团，制得相应的多溴联苯同系物半抗原，然后将半抗原通过活化酯法，分别连接到载体蛋白质上(BSA或者0VA)，半抗原上的羧基先与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)反应生成一个中间物，然后再与蛋白质上的氨基偶联，形成半抗原蛋白质偶联物，即多溴联苯的人工免疫原(或者包被原)(2)针对环境中多溴联苯在自然条件下降解后的产物多为含有3-4个溴的低溴代联苯这种状况，首先采用Friedel-Crafts酰基化反应，在选取的4，4’ -二溴联苯(PBB28)苯环上溴原子的邻位引入了含有四个碳的羧基，制备出相应的半抗原，然后采用活化酯法把大分子蛋白质和半抗原偶联，制备出相应的抗原。(3)使用的试剂价格低，反应时间短，方法后处理简单易操作，适宜于其他多溴联苯同系物的抗原制备。附图说明图I为二溴联苯半抗原红外光谱；图2为二溴联苯抗原紫外吸收光谱图；图3为直接法测定多溴联苯的实时荧光免疫PCR扩增曲线；图4为测定PBB28的标准工作曲线。具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。此外应理解，在阅读了本专利技术讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本专利技术作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。实施例I(I) 4，4’ - 二溴联苯半抗原制备称取4,4’ - 二溴联苯5mmol,溶解于装有20mL CH2Cl2的烧瓶中，加入5mmol的琥拍酸酐，搅拌溶解，在冰浴的条件下，加入12. 5mmol的无水A1C13。在I. 5h内分次加入。密封搅拌IOh后，停止反应，把反应液倾入100ml 2M的盐酸中，然后用50ml X 3的CH2Cl2萃取，用100ml 2M的盐酸洗涤萃取液，用无水硫酸镁干燥，过滤，去除溶剂，得粗品。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种多溴联苯同系物免疫原，其特征在于，该免疫原的结构式如下：FDA00001987834300011.jpg

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：庄惠生，陈寒玉，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：