抗梅毒螺旋体抗体测定试剂制造技术

本发明专利技术提供高灵敏度且高特异性地测定抗梅毒螺旋体抗体的使用了多肽抗原的抗梅毒螺旋体抗体测定试剂以及利用该抗梅毒螺旋体抗体测定试剂的测定方法。一种抗梅毒螺旋体抗体测定试剂，其特征在于，在利用了抗原抗体反应的、用于测定抗梅毒螺旋体抗体的试剂中，将至少包含梅毒螺旋体47kDa抗原中的结构域C和D而不包含梅毒螺旋体47kDa抗原中的结构域A1的重组多肽用作抗原。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及灵敏度和特异性高的抗梅毒螺旋体抗体测定试剂以及使用该抗梅毒螺旋体抗体测定试剂的测定方法。
技术介绍
梅毒是由梅毒螺旋体菌(梅毒螺旋体，Treponema Pallidum)的感染引起的疾病。由于开发出了青霉素等有效的治疗药，梅毒的患病率在1940年以后减少，但近年来再次显示增加的趋势。作为近年来的梅毒新患病患者的特征，可举出大多并发HIV感染病这一点。作为高并发率的原因，认为梅毒、HIV均为性感染病，并且梅毒提高HIV感染风险。在这样的状况下，为了防止扩大梅毒和HIV的感染，要求早期发现并治疗梅毒患者。是否患有梅毒是通过在免疫学上检查血液中是否存在抗梅毒螺旋体抗体来进行·诊断的。在梅毒螺旋体菌体的菌体表面存在大量的表面抗原，通过利用该表面抗原与样品中的抗梅毒螺旋体抗体的抗原抗体反应而进行免疫测定。作为在梅毒螺旋体菌体的菌体表面存在的表面抗原中的主要抗原，已知有分子量为47kDa、42kDa、37kDa、17kDa和15kDa的抗原。现在，作为用于梅毒诊断的梅毒螺旋体菌体的表面抗原，利用如下得到的抗原在家兔睾丸中培养梅毒螺旋体菌，用表面活性剂等进行增溶溶解、提取，进而用各种方法进行不溶物除去、必要成分的纯化。这样制备的来自梅毒螺旋体菌的抗原由于与抗梅毒螺旋体抗体的特异性高，能够早期发现梅毒患者。但是，在如上所述的使用了家兔的抗原制造方法中，由于将家兔睾丸作为宿主，所以产量受到限制，而且梅毒螺旋体菌的增殖状态存在家兔个体差异，难以确保大量稳定的产量。应予说明，目前，直接人工培养梅毒螺旋体菌未获得成功。近年来，提出了利用了基因重组技术的梅毒螺旋体菌的菌体表面抗原的制造方法。对于梅毒47kDa抗原，克隆了编码的基因，确定了由415个氨基酸构成的氨基酸序列(例如，非专利文献I、非专利文献3)。另外，关于其晶体结构、生物学作用也进行了报告，已知A、B、C和D这4个结构域结构(例如,非专利文献2、非专利文献3)。根据非专利文献3，从氨基酸序列的N末端开始数，结构域A由第I 34个(Al结构域)和第157 207个(A2结构域)构成，结构域B由第35 156个构成，结构域C由第208 335个构成，结构域D由第336 415个构成(参照非专利文献3、图I)。进而，关于上述47kDa抗原的抗体识别部位，还报告了显示抗原活性的氨基酸序列(例如，非专利文献4)。作为使用了上述抗原的抗梅毒螺旋体抗体测定方法，公开了利用基因重组技术制作梅毒47kDa抗原并利用该梅毒47kDa抗原在免疫学上测定抗梅毒螺旋体抗体的方法(参照专利文献I)。另外，还公开了使用在15kDa和17kDa的抗原的N末端融合有谷胱甘肽-S-转移酶的蛋白质的方法(参照专利文献2)。另一方面，除了利用基因重组技术的抗原制作以外，关于47kDa抗原，还公开了通过合成具有抗原活性的肽并将其用作抗原而测定抗梅毒螺旋体抗体的方法(参照专利文献3)。专利文献专利文献I :国际公开W01988/02403号小册子专利文献2 :日本特开平7-287017号公报专利文献3 :日本特开2001-264334号公报非专利文献非专利文献I :Infection and Immunity, Vol. 60 (4), ρ· 1568-1576, (1992) 非专利文献2 The Journal of Biological Chemistry, Vol. 277 (44)，p.41857-41864，(2002)非专利文献3 :NCBI (National Center for Biotechnologylnformation), MMDBID :21051非专利文献4 :Journal of immunology, Vol. 157, p. 720-731, (1996)
技术实现思路
虽然用由这样的方法制备的梅毒螺旋体的重组抗原以及合成肽抗原也能够进行抗梅毒螺旋体抗体的测定，但是利用基因重组技术制作的梅毒螺旋体的重组抗原存在灵敏度、特异性低的问题。另外，关于合成肽抗原，除了同样的问题以外，还存在如下问题要精度良好地测定抗梅毒螺旋体抗体，就需要组合多种肽，在操作上繁杂。作为产生这些问题的因素，虽然详细情况还不明确，但可以考虑以下原因。S卩，认为利用基因重组技术制作的梅毒螺旋体的重组抗原与来自梅毒螺旋体菌的天然抗原相比，其立体结构以及脂质的修饰等存在不同。一般地，蛋白质在进行翻译后受到各种修饰。糖或者脂质的修饰等是它们中的代表性修饰，蛋白质通过受到这样的修饰而使其立体结构发生变化。另一方面，在基因重组技术中主要使用的利用大肠杆菌的表达体系中，不进行蛋白质的翻译后的修饰。蛋白质的立体结构在显示其抗原性上是重要的因素，但是利用基因重组技术制作的重组蛋白质由于不受到翻译后的修饰，所以与天然抗原相比，在立体结构上产生不同，考虑这对灵敏度、特异性带来影响的可能性。本专利技术鉴于上述内容，目的在于提供高灵敏度且高特异性地测定抗梅毒螺旋体抗体的使用了多肽抗原的抗梅毒螺旋体抗体测定试剂以及使用该抗梅毒螺旋体抗体测定试剂的测定方法。因此，本专利技术的专利技术人着眼于属于梅毒螺旋体菌体表面抗原的分子量47kDa抗原，利用基因重组技术制作该47kDa抗原及其一部分的多肽，并研究了使用其的抗梅毒螺旋体抗体试剂系中的灵敏度和特异性，结果发现尽管由结构域C构成的重组多肽、以及由结构域D构成的重组多肽的各自单独几乎不反应，但对于由结构域C和D构成的重组多肽，由结构域A2、C和D构成的重组多肽，由结构域B、A2、C和D构成的重组多肽而言，与重组47kDa抗原相比，灵敏度显著提高，其灵敏度能够匹敌天然抗原，从而完成了本专利技术。即，本专利技术如下。(I) 一种抗梅毒螺旋体抗体测定试剂，其特征在于，在利用了抗原抗体反应的、用于测定抗梅毒螺旋体抗体的试剂中，将至少包含梅毒螺旋体47kDa抗原中的结构域C和D而不包含梅毒螺旋体47kDa抗原中的结构域Al的重组多肽用作抗原。(2)根据(I)所述的抗梅毒螺旋体抗体测定试剂，其中，抗原为由梅毒螺旋体47kDa抗原中的结构域C和D，结构域A2、C和D，或者结构域B、A2、C和D构成的重组多肽。(3)根据(I)所述的抗梅毒螺旋体抗体测定试剂，其中，抗原被固定于不溶性载体。(4)根据(2)所述的抗梅毒螺旋体抗体测定试剂，其中，抗原被固定于不溶性载体。 (5) 一种抗梅毒螺旋体抗体测定试剂，其中，(3)所述的不溶性载体为由高分子聚合物构成的乳胶。(6) 一种抗梅毒螺旋体抗体测定试剂，其中，(4)所述的不溶性载体为由高分子聚合物构成的乳胶。(7) 一种抗梅毒螺旋体抗体测定方法，其特征在于，使用(I)所述的抗梅毒螺旋体抗体测定试剂。(8) 一种抗梅毒螺旋体抗体测定方法，其特征在于，使用(2)所述的抗梅毒螺旋体抗体测定试剂。(9) 一种抗梅毒螺旋体抗体测定方法，其特征在于，使用(3)所述的抗梅毒螺旋体抗体测定试剂。(10)—种抗梅毒螺旋体抗体测定方法，其特征在于，使用(4)所述的抗梅毒螺旋体抗体测定试剂。(11)一种抗梅毒螺旋体抗体测定方法，其特征在于，使用(5)所述的抗梅毒螺旋体抗体测定试剂。(12)—种抗梅毒螺旋体抗体测定方法，其特征在于，使用(6)所述的抗梅毒螺旋体抗体测定试剂。根据本发本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：原康之，大田哲也，川本道子，佐藤真也，岩本繁久，岛冈达郎，须藤薰雄，
申请(专利权)人：积水医疗株式会社，日本羔羊有限公司，
类型：
国别省市：