本发明专利技术属于微生物发酵工程领域，具体是利用整合生物加工(Consolidated?Bioprocessing，CBP)技术，通过纤维素降解菌株(如热纤梭菌)发酵降解纤维素产生糖类和有机酸类如葡萄糖，乳酸，乙酸等，联合微藻(如裂壶藻、小球藻和微拟球藻)的大规模异养或兼养培养，串联发酵生产生物柴油和联产高附加值副产品如二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸、蛋白质饲料等。其特征是利用厌氧纤维素降解细菌降解经过预处理的木质纤维素原料，使其中的纤维素和半纤维素转变为可溶性糖类和有机酸类等微藻能够利用的碳源，利用这种碳源并补加一定氮源和其它营养元素后，接入微藻种液进行后续发酵，积累油脂生产生物柴油和其它高附加值产品。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及微生物发酵工程领域，具体是利用整合生物加工(ConsolidatedBioprocessing,CBP)技术，建立以纤维素降解菌株(如热纤梭菌)发酵降解纤维素产生糖类和有机酸类如葡萄糖，乳酸，こ酸等，联合微藻(如裂壶藻和微拟球藻)的大規模异养或兼养培养，发酵生产生物柴油和具有高附加值的产品如二十碳五烯酸(EicosapentaenoicAcid, EPA)和二十ニ碳六稀酸(Docosahexaenoic acid, DHA)的串联发酵エ艺。
技术介绍
随着全球能源和环境危机的加剧，寻求替代能源已成为许多国家的研究热点，这其中清洁，可再生的生物能源是替代能源研究的重要方面，生物柴油是新能源中替代石化柴油的最适合产品，在欧美等国已作为石化柴油添加剂开始使用，但要规模化应用还存 在一定的瓶颈，即原材料的选择和生产エ艺中涉及成本的问题。纤维素是地球上最丰富的可再生资源，但只有极少数被有效利用，绝大部分被作为废物弃置在环境中，反而造成一定的环境污染，比如城市垃圾。所以用纤维素物料生产新型生物燃料，因为具有重大战略意义而引起世界各国的广泛重视(闻志强，姜薇，2010)。但是木质纤维素由于极其复杂的结构，导致其降解十分困难(Christian Weber & AlexanderFarwick et. al,2010)。嗜热厌氧的热纤梭菌(Clostridium thermocellum)因能直接将纤维素转化为单糖而吸引了众多研究者的注意力(Lynd. et al,2002)。研究表明(Lamedr,1984)，厌氧纤维素降解细菌中广泛存在的纤维小体(cellulosome)是其能够直接把纤维素转化为单糖的关键所在，因为纤维小体具有类似核糖体的大分子结构，能协调、有序、高效地降解纤维素。微藻作为ー种新型水生生物质资源，具有生长周期短、生物质产量高和油脂含量高的特点，其生物质生产能力可达陆地植物的30倍，具有不与粮争地及不与人争粮的巨大优势；微藻在可再生能源领域有非常吸引人的巨大发展潜力，如微藻具有很强的油脂生产能力，其油脂含量可高达细胞干重的40-80%。因此，微藻有可能为我国生物质能资源短缺提供一条有效解决途径，开发能源微藻资源，发展能源微藻生物炼制产业，不仅符合我国可持续发展的能源战略需求，而且符合我国建立资源节约型和环境友好型社会的目标，有助于促进人与自然和谐发展与经济社会可持续发展。利用异养方式大規模培养微藻具有以下优势(1)微藻生长繁殖速度加快，藻生物量浓度大大提高在异养培养时，藻细胞浓度可达到或接近大肠杆菌及酵母的浓度。(2)从エ业化角度分析，异养培养系统更便于生产过程的控制以实现纯种培养及稳定的生产。(3)使用异养培养系统可降低微藻生产成本。裂壶藻Schizochytrium Iimacinum是ー种重要的海洋经济微藻,其特点是生长快、抗逆性强、脂类含量高(达到细胞干重的50%以上，且细胞中90%以上的油脂以甘油三脂的形式存在)。此外，在它的脂肪酸中C14:0，C16:0，C22:5(DPA)，C22:6(DHA)，占总脂肪酸含量的90%左右，具有很高的营养价值并且相对容易分离，可以通过副产高附加值产品进ー步提高生物柴油的经济性，因此裂壶藻被认为是最具潜力的能源微藻物种之一。微拟球藻(Nannochloropsis sp.)是ー种单细胞的海洋绿藻，具有利用こ醇、醋酸盐和葡萄糖等有机碳进行混合营养生长的能力。提高培养液中CO2浓度或添加葡萄糖，可以促进微拟球藻细胞的生长和油脂产率(Hu & Gao 2003 ；Xu et al.，2004)。微拟球藻属(NannochlOTopsis)的种类通常具有很高含量的油脂含量(能达到细胞干重的50% -80% )，EPA含量能达到油脂的30% _40%，因而被认为有望成为生产生物柴油和EPA产品的生物资源(Sukenik 1999)。整合生物加工技术(Consolidated BioProcessing,简称“CBP”)针对当前纤维素利用技术中采用単元操作与集成优化模式面临的诸多挑战，通过将纤维素酶的生产、纤维素的酶水解、戊糖发酵与己糖发酵等原本分立的反应步骤进行整合，因此大大降低运行成 本，从而提高纤维素生物转化利用的综合技术经济指标。基于这些显著的特色，CBP被认为是最有前景的低成本纤维素生物转化利用技术路线之一。现有生物柴油的生产存在着成本高，与人争粮等诸多问题。因此，寻求ー种低成本，又能利用的非粮食作物作为底物实现生物柴油的生产是本专利技术所面临的新课题。
技术实现思路
本专利技术建立了以厌氧纤维素降解细菌(如热纤梭菌和解纤维梭菌)发酵降解纤维素产生糖类和有机酸如葡萄糖，乳酸，こ酸等，联合微藻(如裂壶藻和微拟球藻)的大规模异养或兼养培养，发酵生产生物柴油和具有高附加值的多不饱和脂肪酸如二十碳五烯酸(Eicosapentaenoic Acid, EPA)和二十ニ碳六烯酸(Docosahexaenoic acid, DHA)的串联发酵エ艺。所要解决的技术问题可以通过以下方案来实现I.木质纤维素(秸杆)的预处理。将秸杆与浓度为20%-30%的氢氧化钙(Ca(OH)2)溶液按照I : 7_1 15的固液比混合，加热至90-120°C并保持100-150min，处理结束后冷却至室温，加入稀酸调节悬池液pH为7. 5-8. O。此混合液即可作为热纤梭菌(Clostridium thermocellum)或解纤维梭菌(Clostridium cellulolyticum)降解纤维素生产后续CBP发酵所需碳源的底物。2.热纤梭菌发酵生产下游发酵所需的混合碳源热纤梭菌高密度发酵培养基配方KH2P04 I. 0-1. 5g/L，K2HPO4 4. 0-10. Og/L，氮源3. 0-7. 0g/L, MgCl2 6H20 I. 0-5. Og/L, CaCl2 2H20 50_250mg/L，FeSO4 6H20 0. 5-2. 5mg/L, Cysteine hydrochloride I. 0-5. Og/L, Resazurin I. 0-10. Omg/L,碳源 10. 0-40. Og/L, Morpholinopropane sulfonic acid(MOPS)5. 0-20. Og/L, Yeast extract 5. 0_20g/L,Sodium citrate 2H20 0. 2_1. 5g/L配制发酵培养基,并灭菌。其中，碳源为纤维素质生物质(包含但不限于秸杆，木菊)，氮源为有机或无机氮源(包含但不限于尿素，酵母提取物，蛋白胨，玉米浆，硝酸钠，谷氨酸钠)；灭菌前调节PH为7. 0-8.5 ;若需扩大底物浓度，则仍应保持碳氮比为2 1-10 I。热纤梭菌的发酵条件为温度50°C _65°C，厌氧，罐压为0. 05MPa-0. 5MPa，搅拌转速为30-100rpm。高底物浓度(碳源浓度大于15g/L)发酵时应控制pH恒定为7. 0-7. 5左右，发酵时间为12-48h。3.热纤梭菌发酵液的分离和微藻利用CBP串联的大规模异养培养热纤梭菌发酵结束后，发酵液用离心机进行分离，弃去固体收集液体，分离的发酵液中本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种木质纤维素生产生物柴油的方法，其特征是利用整合生物加工技术(CBP)，以木质纤维素降解菌株降解纤维素产生糖类和有机酸如葡萄糖，乳酸，乙酸等，联合微藻的大规模异养或兼养培养，发酵生产生物柴油和具有高附加值的多不饱和脂肪酸的串联发酵工艺，包括以下步骤：1)木质纤维素(秸秆)的预处理将秸秆与氢氧化钙(Ca(OH)2)溶液按照1∶7？1∶15的固液比混合，加热至90？120℃并保持60？150min，处理结束后冷却至室温，加入稀酸调节悬浊液pH为7.5？8.0；2)降解纤维素发酵生产下游发酵所需的混合碳源热纤梭菌高密度发酵培养基配方：KH2PO4？1.0？1.5g/L，K2HPO4？4.0？10.0g/L，氮源3.0？7.0g/L，MgCl2·6H2O？1.0？5.0g/L，CaCl2·2H2O？50？250mg/L，FeSO4·6H2O？0.5？2.5mg/L，Cysteine？hydrochloride？1.0？5.0g/L，Resazurin？1.0？10.0mg/L，碳源10.0？40.0g/L，Morpholinopropane？sulfonic？acid(MOPS)5.0？20.0g/L，Yeast？extract？5.0？20g/L，Sodium？citrate·2H2O？0.2？1.5g/L配制发酵培养基，并灭菌；发酵条件为：温度50℃？65℃，厌氧，罐压为0.1MPa？0.5MPa，搅拌转速为30？100rpm，pH为7.0？7.5，发酵时间为12？48h；3)利用CBP技术串联的大规模培养微藻热纤梭菌发酵结束后，发酵液用离心机进行分离，弃去固体收集液体，分离的发酵液中糖含量在10％？20％，加入海水(或人工海水)进行稀释，同时控制稀释后液体的盐度在10？36之间。向混合液中添加适量的氮源，维生素，配制成培养液进行微藻的发酵培养；小球藻或裂壶藻异养发酵培养基的配方：碳源7％？10％，氮源2％？4％，维生素B1，10？50mg/L；维生素B6，10？30mg/L；维生素B12，1？10mg/L；生物素(维生素H)1？10mg/L；小球藻或裂壶藻的发酵条件为：温度23℃？28℃，通气量0.5？2.0L？min？1？L？1，罐压为0.04MPa？0.08MPa，搅拌转速为100？250rpm，控制pH为5.0？7.5，发酵时间为72？96h；微拟球藻培养基的配方：碳源0.1％？1％，KNO3？300？500mg/L；NaH2PO4·2H2O？40？70mg/L；FeCl3·6H2O？6？15mg/L；CuSO4·5H2O？0.01？0.05mg/L；ZnSO4·7H2O？0.02？0.08mg/L；CoCl2·6H2O？0.01？0.05mg/L；MnCl2·4H2O？0.3？0.5mg/L；NaMoO4·2H2O？0.01？0.05mg/L；thiamine·HCl？100？500μg/L；维生素B12，1？10μg/L；生物素(维生素H)1？10μg/L；微拟球藻的兼养发酵条件为：温度20℃？28℃，通气量0.1？0.5L？min？1？L？1，罐压为0.02MPa？0.05MPa，搅拌转速为30？100rpm，光照强度50？300μmol？photons？m？2？s？1，控制 pH为5.0？7.5，培养时间为8？10天。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：崔球，宋晓金，朱新术，高莽，刘亚君，
申请(专利权)人：中国科学院青岛生物能源与过程研究所，
类型：发明
国别省市：
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