包含淀粉结合部位的重组蛋白质及其用途制造技术

一种包含淀粉结合部位的重组蛋白质及其用途。本发明专利技术涉及一种新颖的淀粉结合部位(SBD)及其用途。本发明专利技术提供一种包含淀粉结合部位的纤维。本发明专利技术亦提供一种鉴别候选淀粉分解酶的淀粉结合部位的配体结合位点的方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及根霉属真菌(Rhizopus spp.)的葡萄糖淀粉酶的淀粉结合部位(SBD)的功能。包含SBD的重组蛋白质的生产及纯化可通过使用SBD作为标签。本专利技术尤其涉及一种纯化该重组蛋白质的新颖方法和试剂盒以及SBD和该重组蛋白质的新颖应用。本专利技术提供一种包含淀粉结合部位的纤维。本专利技术亦提供一种鉴别候选淀粉分解酶的淀粉结合部位的配体结合位点的方法。
技术介绍
通过在微生物系统内表现来生产蛋白质已成为高价、医药上的重要蛋白质的重要来源。重组蛋白质的纯化和回收是发酵工艺设计上的重要考虑。传统的蛋白质纯化方法可用以纯化产物，而改良的方法，包括使用重组蛋白质，重组蛋白质可通过亲和性管柱层析法加以纯化，所欲纯化的重组蛋白质的组分可通过其与亲和性基质上结合的多肽形成共价性 连结而被纯化。某些系统通过亲和性管柱层析的原理来分离蛋白质。美国专利第5643758号说明一种包含麦芽糖结合蛋白质(MBP)的系统。将一种经选殖的基因嵌入编码MBP的malE基因下游的pMAL载体内。将此载体转形至宿主细胞，然后该重组蛋白质可于宿主细胞内表达。将细胞溶离物或培养基分层载入含有亲和性基质-直链淀粉的管柱中并洗涤数次，再使用大量的麦芽糖溶离重组蛋白质。美国专利第5202247号说明一种包含纤维素_结合部位的系统。使用纤维素管柱纯化含有纤维素-结合部位的重组蛋白质。将细胞溶离物或培养基分层载入该管柱并加以洗涤。纤维素-结合部位和纤维素间的交互作用可通过中性PH下的疏水性交互作用加以驱动。一般溶离方法使用低极性溶液，例如乙二醇，之后以透析和过滤移除低级性溶剂。几丁质-结合部位和可诱导的接合连接子区可融合于标的蛋白质的C端或N端。将细胞溶离物或培养基分层载入该管柱并加以洗涤。将几丁质-结合部位结合于几丁质管柱以固定重组蛋白质。在硫醇(例如DTT或半胱胺酸)存在之下，该连接子区会进行特定的自我切割以自几丁质-结合性几丁质-结合部位释出标的蛋白质。上述这些现行的蛋白质纯化系统具有一些缺点。其纯化过程既不方便且又费力。使用于纯化的管柱昂贵。上述这些蛋白质纯化系统的限制包括不能在某些条件之下纯化重组蛋白质，例如含EDTA的样本及目前所使用的蛋白质标签与本专利技术所使用者相比之下，其比标的蛋白质相对较大。
技术实现思路
本专利技术提供一种具特征性解离常数(Kd)O. 5 2. 29 μ M的淀粉结合部位(starchbinding domain,SBD)。本专利技术亦提供一种重组蛋白质,其包含本专利技术的多肽和一淀粉结合部位。本专利技术亦提供一种表达载体,其包含一种编码本专利技术的淀粉结合部位的基因。本专利技术亦提供一种宿主细胞，其经一种用以复制及表现编码包含本专利技术的目标多肽及淀粉结合部位的DNA的载体转形或转染。本专利技术进一步提供一种自生物性液体纯化出包含本专利技术的多肽和淀粉结合部位的重组蛋白质的方法。本专利技术进一步提供一种试剂盒，其用以纯化包含用以表现重组蛋白质的表现载体的重组蛋白质。本专利技术进一步提供一种在含有各种碳水化合物分子的样本中分类含碳水化合物的分子的方法。本专利技术进一步提供一种包含淀粉结合部位的纤维，其中该纤维通过β面_β面交互作用及/或电荷-电荷交互作用所形成。本专利技术亦提供一种鉴别候选淀粉分解酶的淀粉结合部位的配体结合位点的方法。附图说明图I说明使用淀粉进行SBD-6H纯化的结果。使经纯化的SBD-6H进行SDS/PAGE (15%胶体)且将该胶体以考马西蓝(Coomassie Brilliant Blue) R-250染色以进行蛋白质检测。第I道分子量标准品(分子量标于左侧)；第2道2毫克的在玉米淀粉上纯化的SBD-6H。图2说明pH对结合能力和稳定性的影响。如实验说明所述，在不同的pH下测定 SBD-6H的结合能力(·)和安定性(ο)。将在pH5中分析到的相对结合能力定为100%。 图3说明SBD-6H与不溶性淀粉的吸附速率。通过载入不同浓度的SBD_6H(15.6μΜ；Α,22.5μΜ；·,27.2μΜ)于玉米淀粉5小时来分析SBD结合速率。由起始和未结合蛋白质于不同时间点的浓度差计算出结合蛋白质，用以测定结合速率。图4说明SBD-淀粉交互作用的Kd和Bmax测定。以颗粒状玉米淀粉在不同蛋白质浓度下进行淀粉结合分析。通过适配于单一结合位点饱和结合的结合等温线的非线性回归来测定Kd和Bmax。图5显不经SBD标定的融合蛋白质的构建eGFP ;编码绿色突光蛋白质的基因；SBD :淀粉结合部位；Knf :卡那霉素(kanamycin)抗性基因。图6说明使用淀粉进行SBD标定的融合蛋白质的纯化结果。将经纯化的融合蛋白质进行SDS/PAGE(15%胶体)且将该胶体以考马西蓝R-250染色以进行蛋白质检测。第I道分子量标准品(分子量标于左侧)；第2道可溶性区分和第3道溶离物。箭头I :SBD-eGFP，箭头 II :eGFP 和箭头 III SBD.图7说明CBM20和CBM21的以结构为基础的多重序列比对的比较。(A)与毛霉(R. oryzae)(RoGACBM21)、卷枝毛霉(M. circinelloides)(McGACBM21)，A. adeninivorans(AnGACBM21)、Lipomyces kononenkoae-淀粉酶(LkACBM21)、人类蛋白质磷酸酶(HsPPCBM21)和黑曲菌(A. niger)(AnGACBM20)的SBD的以结构为基础的多重序列比对。白色、黑色和灰色片段分别代表预测的二级结构组件环、股和α-螺旋。黑色的Y、W和F分别表示环区内的酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸；白色的Y、W和F代表β -股内的芳香性残基。(B)使用PSSC算法分别以标示于图上方和下方RoGACBM21和AnGACBM20的系统化序列所进行的以结构为基础的序列比对。β代表一 β股；Ν代表环区中无芳香性残基。AnGACBM20内的关键配体结合残基以双底线标明。(C)以已知结构和配体结合位点的黑曲菌(A. niger) (AnGACBM20)作为模板根据本专利技术的二级结构和拓朴学图谱分析法所模拟的毛霉(R. oryzae) (RoGACBM21)、卷枝毛霉(M. circinelloides) (McGACBM21)、A. adeninivorans (AnGACBM21)、Lipomyceskononenkoae -淀粉酶(Lk ACBM21)、人类蛋白质磷酸酶(HsPPCBM21)的三维结构和推定的配体结合位点。图8说明使用以结构为基础的序列比对的RoGACBM21分子模型。(A)RoGACBM21和AnGACBM20内的β -股位置，以不同深浅的灰色箭头代表，其分别标示在序列的上方和下方。AnGACBM20内的配体结合位点以底线标示(结合位点I 、结合位点II _)。RoGACBM21内的经预测涉及碳水化合物结合的芳香性残基以灰色标示。(B)RoGACBM21(左侧)的模型结构和AnGACBM20的模板结构(右侧，蛋白质数据库编号1AC0)以带状图显示。形成RoGACBM21的第一个β股中自Ala1至Ser13的多肽序列并未显示于模型中。AnGACBM20内的配体(PCD)和特征配体结合位点的侧链以及RoGACBM21的潜在结合位点亦绘于图中。(C本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种淀粉结合部位，其特征在于包含0.5～2.29μM的解离常数的特性。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：张大慈，许嘉钦，
申请(专利权)人：善笙生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：