谷蛋白引起的自身免疫性疾病的诊断制造技术

本发明专利技术涉及通过利用存在于谷氨酰胺转移酶家族蛋白质上的主要乳糜泻抗原表位的结合分析对谷蛋白引起的自身免疫性疾病的选择性诊断。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及通过使用存在于谷氨酰胺转移酶家族的蛋白质上的主要乳糜泻抗原表位(main celiac epitope)的结合测定，以进行谷蛋白引起的自身免疫性疾病的选择性诊断。
技术介绍
乳糜泻(也称为乳糜泻病、非热带性口炎性腹泻或谷蛋白敏感性肠病)是一种疾病的环境诱因已知的独特的自身免疫性障碍。所述障碍出现在有人类白细胞抗原(HLA)DQ2或DQ8背景的具有遗传倾向的人中，其特征在于慢性肠道炎症、吸收不良以及由于摄入谷蛋白导致的自身抗体生成。除了肠病外，谷蛋白还能引起搔痒性和发疱性皮疫，在此情况下,所述疾病称为疱疹样皮炎。通过去除患者饮食中的谷蛋白可成功地治疗所述疾病,但对于持续的反应则应终生遵照所述治疗。 摄取小麦、裸麦和大麦中的谷蛋白部分引起乳糜泻发病。麦醇溶蛋白是谷蛋白的醇溶性部分，并且含有显示对患者有毒的肽混合物。已鉴定了 33聚体的a-麦醇溶蛋白衍生的肽为谷蛋白最具有免疫原性的部分，所述肽耐胃蛋白酶、胰蛋白酶和刷状缘膜蛋白酶消化，并且可以经过肠上皮以引起固有层中的免疫应答[Shan L et al, Science. 2002 ；297 :2275-9.]。上段小肠中的慢性炎症细胞浸润、绒毛萎缩和隐窝增生是所述疾病的典型特征，同时它也能导致肠外症状，例如贫血、神经性障碍或称为疱疹样皮炎的皮肤病。所述疾病最初出现在以小麦作为基本食物的西方人群中(欧洲、美国、澳大利亚)，但是最近也已出现在中东、南美洲、北非和亚洲。筛查发现，在1.0%的芬兰学龄儿童[Maki M et al. N Engl J Med. 2003 ;348 (25) :2517-24. ]、0. 75% 的美国“无风险”群体[Fasano A et al, Arch Intern Med. 2003 ； 163 (3) :286-92.]和 I. 4% 的匈牙利六岁儿童[Korponay-Szabo IR et al, BMJ. 2007 ；335(7632) :1244-7.]中发现所述疾病。所述疾病具有大范围的各种临床表现，例如腹泻、腹胀、贫血、体重减轻、生长缓慢、皮肤或神经症状，并且可在任何年龄诊断出该病。由于缺乏适当的吸收，可出现维生素和矿物质缺乏，例如维生素B12、维生素K、叶酸、铁和钙缺乏。许多患者也许仅有隐蔽症状，在这类情况下，经常延迟了适当的诊断。未治疗的乳糜泻具有严重并发症，如腺癌(具有与普通人群相比差不多两倍的风险)、T细胞淋巴瘤(具有大约五十倍风险)和骨质疏松。乳糜泻的当前诊断标准由欧洲儿科胃肠病学和营养学会建立，并且需要来自小肠上部的活检样品、特征为上皮内淋巴细胞增多的组织学检查(十二指肠活检)，也应该观察隐窝增生和绒毛萎缩以及对不含谷蛋白饮食的有利应答。如果显示患者血液中含有能结合沿着环绕平滑肌细胞的结缔组织片的正常组织切片的某些自身抗体(肌内膜抗体)或沿着网硬蛋白纤维结合正常组织切片的自身抗体(R1-网硬蛋白抗体结合模式)，也支持乳糜泻的诊断[Green PH, Cellier C，N Engl J Med. 2007 ；357(17) :1731-43.]。所述疾病被严重漏诊，十个患者中仅有两个被临床上识别。其主要原因在于并不是全部患者都产生临床表现(无症状病)，有些患者甚至可长时间具有正常的粘膜形态[Maki M, Collin P, Lancet. 1997 ;349 (9067) : 1755-9.]。然而，他们具有高密度上皮内淋巴细胞或具有阳性乳糜样肠抗体模式，对于网硬蛋白和肌内膜组织自身抗体通常为阳性。所述称为潜伏或潜在乳糜泻的疾病的亚群是诊断方面的挑战，并且这些患者在晚些年可能出现绒毛萎缩和隐窝增生，或者可能在其他器官中产生严重的(有时不可逆的)损伤(谷蛋白共济失调、心肌病、糖尿病、甲状腺机能减退)。难以对处于潜伏期的患者进行诊断，因为患者最初经常达不到常规诊断标准并且需要长期随访。抗体水平可随时间波动，并且目前还没有好的装置用来准确地预测在不久的将来哪些对象将会恶化[Simell S et al, ScandJ Gastroenterol. 2005 ;40 (10) :1182-91.]。因此，基于小肠中确定的绒毛损伤的当前诊断标准有不足，需要改订(Kaukinen Ket al, Dig Dis Sci. 2001 ；46 =879-87.) 0另外，小肠活检是不愉快的侵入性诊断程序，用抗体阳性替代基于活检的诊断标准将具有一些实用的优点，也具有将患有早期疾病的对象计入和及时明确叙述治疗适应症的可能性。 长期以来，已经公认需要更简单更可耐受的初步诊断工具。越来越多地使用血清学试验，所述血清学试验基于患者血液中抗麦醇溶蛋白、网硬蛋白、肌内膜和2型谷氨酰胺转移酶(TG2)的循环抗体的检测。所述血清学试验也可用于发现具有轻度症状或非典型临床表现的患者，并可用于筛选一级亲属或风险群体。主要风险群体包含患有糖尿病、唐氏综合征、选择性IgA缺陷和各种经常与乳糜泻共存的自身免疫性障碍(如自身免疫性甲状腺病、Sj6gren综合征、红斑狼疮、自身免疫性肝病、脱发、肾小球疾病和心脏病)的患者[Green PH, Cellier C，N Engl J Med. 2007 ;357 (17) :1731-43.]。对于乳糜泻，抗麦醇溶蛋白抗体没有显示足够的灵敏度或特异性，尽管如此，基于与TG2具有结构相似性的脱酰胺基的麦醇溶蛋白肽的试验是相对有效的[Volta U et al,Dig Dis Sci. 2008 ；53(6) :1582-8. ；Korponay-Szabo IR et al, J Pediatr GastroenterolNutr. 2008 ；46(3) :253-61.]。使用间接免疫荧光分析监测肌内膜IgA抗体可提供高准确度，因为所述抗体为所述疾病的高度特异性标志物。然而，肌内膜抗体试验的评价多半取决于观察者，需要高度熟练且训练有素的人员，因此不能广泛用于每个医疗机构中。选择性IgA缺陷是乳糜泻患者中的常见特征(40例中的I例)，使得很难通过常规肌内膜抗体试验识别患者。在这些情况下，应该检测IgG类抗TG2自身抗体[Korponay-Szabo I et al,Gut. 2003 ；52(11) :1567-71]。此外，肌内膜试验不能鉴别所述疾病的显在形式和潜伏形式(Green PH, Cellier C，N Engl J Med. 2007 ；357(17) :1731-43.)。因此，在本
中需要可靠且更易使用的试验。人们已经发现TG2(也称为组织、红细胞或细胞谷氨酰胺转移酶)是主要的本身自身抗原和用于乳糜泻中肌内膜和网硬蛋白抗体的靶标。所述酶为以Ca2+依赖方式催化谷氨酰胺的Y-羧酰胺基和赖氨酸残基的e-氨基之间酰基转移反应(共价蛋白质交联)的谷氨酰胺转移酶超家族的成员(EC2. 3. 2. 13)。TG2除了能催化胺类并入蛋白质中(位点特异性脱酰胺作用)之外，还具有异肽酶活性，并且通过其鸟苷三磷酸酶(GTPase)活性参与跨膜信号传导。TG2可从细胞表面化，其与结合素类和纤连蛋白复合，促进胞外基质的重塑和装配，并且介导细胞一基质相互作用。这样，TG2本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2009.04.01 HU P09001991.诊断对象中谷蛋白引起的自身免疫性疾病的方法，其包括步骤 i)提供从对象获取的生物学样品，所述样品含有所述对象的自身抗体，并且任选地从所述样品中分离自身抗体， ii)使所述样品的自身抗体接触 -属于谷氨酰胺转移酶家族并具有完整的主要乳糜泻抗原表位的参考蛋白质， -属于谷氨酰胺转移酶家族的至少一种测试蛋白质，其中，与具有完整的主要乳糜泻抗原表位的参考蛋白质相比，对所述主要乳糜泻抗原表位有贡献的至少一个表面氨基酸残基的侧链和/或空间位置被改变， 其中，所述主要乳糜泻抗原表位的所述至少一个表面氨基酸残基包括或选自核心结构域的第一个α-螺旋的表面氨基酸残基，优选所述α-螺旋的第一个氨基酸残基，和/或 β夹层结构域的第一个α-螺旋的表面氨基酸残基和所述β夹层结构域的保守Hi sHi sThr基序的表面氨基酸，优选所述螺旋的第六个氨基酸残基和/或所述Hi sHi sThr基序的第一个氨基酸， 并且其中所述核心结构域具有折叠的三维结构， iii)评价所述自身抗体与所述参考蛋白质和所述至少一种测试蛋白质的结合特性， 其中，与参考蛋白质相比，如果自身抗体与测试蛋白质的结合受损，这个事实视为代表所述对象具有谷蛋白引起的自身免疫性疾病。2.权利要求I的诊断对象中谷蛋白引起的自身免疫性疾病的诊断方法，其中，在步骤iii)中，通过测量所述自身抗体与所述测试蛋白质和与所述参考蛋白质的结合水平评价所述结合， 其中，如果所述自身抗体与所述参考蛋白质的平均结合水平超过预定阈值，并且如果自身抗体与测试蛋白质的平均结合水平显著低于与参考蛋白质的结合水平，优选降低至少30 %，这个事实视为代表所述对象具有谷蛋白引起的自身免疫性疾病。3.权利要求I或2的诊断方法，其中 基于氨基酸序列比对，所述核心结构域的第一个α-螺旋的第一个氨基酸残基是与Glul53对应或相当的氨基酸残基，所述Glul53根据全长人TG2的氨基酸编号而编号，和/或基于氨基酸序列比对，所述β夹层结构域的第一个α-螺旋的第六个氨基酸残基是与Argl9对应或相当的氨基酸残基，所述Argl9根据全长人TG2的氨基酸编号而编号，和/或基于氨基酸序列比对，所述β夹层结构域的第一个α -螺旋的HisHisThr基序的第一个氨基酸残基是与His22对应或相当的氨基酸残基，所述His22根据全长人TG2的氨基酸编号而编号， 其中优选 a)所述测试蛋白质是突变谷氨酰胺转移酶(TG)，优选突变TG2、TG3或TG6，和 b)所述参考蛋白质是野生型TG，优选野生型TG2、TG3或TG6。4.权利要求I至3任一项的诊断方法，其中，与具有完整的主要乳糜泻抗原表位的参考蛋白质相比，属于谷氨酰胺转移酶家族的测试蛋白质中，至少另外一个氨基酸的侧链和/或空间位置被改变，其中优选地，基于多序列比对，所述另外的氨基酸选自与根据全长人TG2的氨基酸编号而编号的 Argl51、Glul53、Glul54、Argl56、Argl9、His22、Val431、Arg433、Glu435、Met659和Leu661对应或相当的氨基酸残基。5.权利要求I至4任一项定义的测试蛋白质在乳糜泻诊断方法中的用途，所述测试蛋白质属于谷氨酰胺转移酶家族，其中，与具有完整的主要乳糜泻抗原表位的参考蛋白质相t匕，所述测试蛋白质中至少一个对主要乳糜泻抗原表位有贡献的表面氨基酸残基的侧链和/或空间位置被改变，其中所述主要乳糜泻抗原表位的所述至少一个表面氨基酸残基包括或选自 所述核心结构域的第一个α-螺旋的表面氨基酸残基，和/或所述β夹层结构域的第一个α-螺旋的表面氨基酸残基和所述β夹层结构域的保守HisHisThr基序的表面氨基酸残基， 并且其中所述核心结构域具有折叠的三维结构。6.用于诊断对象中谷蛋白引起的自身免疫性疾病的诊断方法，其包括步骤 i)提供从对象获取的生物学样品，所述样品含有所述对象的自身抗体，并且任选地从所述样品中分离自身抗体， )将所述样品的自身抗体接触属于谷氨酰胺转移酶家族的蛋白质，所述蛋白质具有完整的主要乳糜泻抗原表位，和 iii)评价所述自身抗体与所述TG家族蛋白质在不存在和存在测试化合物时的结合水平，所述测试化合物已知能够与主要乳糜泻抗原表位结合，所述主要乳糜泻抗原表位至少部分地由 所述核心结构域的第一个α-螺旋的一个或多个表面氨基酸残基，和/或所述β夹层结构域的第一...

【专利技术属性】
技术研发人员：I·科尔波瑙伊绍博，L·费许什，P·鲍戈斯，E·彻斯，R·基拉伊，Z·西蒙韦切伊，M·马基，
申请(专利权)人：德布勒森大学，
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