本发明专利技术公开了一种O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶活性的检测方法，即首次采用生物发光共振能量转移技术和化学发光技术免疫检测O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶活性：将链亲和素-荧光素酶融合蛋白与生物素标记的O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶在0～40℃孵育30～60min，再加入荧光染料标记的O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶抗体，0～40℃孵育30～60min，然后再加入荧光素底物，4～30℃下静置5～30min，检测670nm处的发光强度，进而计算获得O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶活性；本发明专利技术方法操作简便，应用范围广，避免了外源激发光所引起的散射和样品基质荧光等本底的干扰，具有更高的灵敏度和准确度。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶活性的检测方法，特别涉及采用生物发光共振能量转移技术和化学发光技术免疫检测O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶活性的方法。
技术介绍
烷化剂是最大一类抗肿瘤药物，临床上常用的例子有环磷酰胺、尼莫司汀、卡巴嗪、硝卡芥、氮芥和替莫唑胺等，广泛用于治疗脑、头颈、肝、食管、肺、泌尿、生殖、血液等恶性肿瘤。烷化剂药物对肿瘤细胞的杀伤主要是通过对DNA分子的鸟嘌呤O6位上的烧基化而实现的，而O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(O6-MethylguanineDNA-Methyltransferase, MGMT)的存在能够去除这种烷基加合物，使肿瘤细胞和正常细胞得以生存而产生所谓的耐药性，是哺乳动物细胞修复烷化剂所造成DNA损伤的一个重要环节。其作用机理是将烷基加合物从O6-鸟嘌呤的O6位转移到自身半胱氨酸残基上，使DNA链上的鸟嘌呤复原，同时自身不可逆的失活，以此方式来实现修复。如果肿瘤细胞中的MGMT水平过高可能会导致耐药，而对于正细胞却可能减少其化疗的毒副作用。如何控制MGMT水平以达到最佳的化疗效果是如今MGMT研究的热点。而且，MGMT在预测肿瘤化疗的效果以及制订个体化治疗方案的潜在价值已被大量实例研究所证实并被医学界广泛认可。因此，如何灵敏、准确地检测MGMT在细胞中的含量，对提高化疗效果以及减少药物毒副作用有着重要的意义。目前还没有一种简易可靠、可应用于常规临床检验的方法来测定MGMT的活性。大量文献描述MGMT基因启动子甲基化以及MGMT蛋白表达的免疫测定，并试图建立这些分子生物学和血清学指标与肿瘤耐药性、生存率以及个体化治疗方案的相关性，但这些烦琐而且不稳定的检测方法不适合在临床上常规使用，而且它们不直接测定MGMT的酶学活性可能会引入各种与肿瘤耐药机制无关的干扰因素。而基于同位素标记底物的MGMT活性测定法只适用于实验室研究，而难以被用于常规临床检验中。此外，这种方法所用的蛋白沉淀步骤容易引入诸如黑色素(Melanin)等蛋白的非特异结合所引起的假阳性。也有人用非同位素标记的底物和酶联免疫分析方法来测定MGMT活性，但这个方法所需的多步而费时的固相分离和反应从临床应用和检测效率(灵敏度)的角度来看是个明显的缺点。上世纪末Xu Y.等人发现，荧光素酶(Luciferase)和荧光素反应所产生的生物发光可以转移并激发与之靠近的荧光色团，这就是所谓的生物发光共振能量转移(Bioluminescence Resonance Energy Transfer, BRET)现象。如果将突光素酶和突光色团分别标记在有亲和力的两个生物分子上，那么这对分子的结合就可以通过因这种结合所带来的BRET所表示出来。这种BRET技术具有匀相检测(即不需要分离)以及无激发本底两个优点，且具备操作简便和高灵敏度两大方法学优势，很快就在研究蛋白质相互作用以及亲合结合分析方面得到了广泛的应用。尽管这样，到目前为止还没有应用BRET来测定MGMT活性的报道。本专利技术结合化学发光技术，首次提出采用BRET的方法测定O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶活性，该方法利用BRET技术和化学发光技术的优势来解决临床常规MGMT活性测定难题，将为个体化的肿瘤治疗的现代临床实践提供技术支撑。
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶活性的检测方法，该方法为操作简便、特异性好和灵敏度高的匀相MGMT活性测定方法。本专利技术采用的技术方案是一种O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶活性的检测方法，所述方法为 (I)将待测O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶与生物素标记的O6-甲基鸟嘌呤反应，获得生物素标记的O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶，所述生物素为维生素H ；(2)将链亲和素-荧光素酶融合蛋白与生物素标记的O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶在(T40°C孵育3(T60min，使链亲和素-荧光素酶融合蛋白中的链亲和素与生物素标记的O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶中的生物素结合，形成O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶-生物素与链亲和素结合体-荧光素酶融合蛋白复合物，再加入荧光染料标记的O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶抗体，(T40°C孵育3(T60min，使荧光染料标记的O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶抗体与O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶-生物素与链亲和素结合体-荧光素酶融合蛋白复合物一端的O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶结合，形成荧光染料标记的O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶-生物素与链亲和素结合体-荧光素酶融合蛋白复合物，然后再加入荧光素底物，4 3(TC下静置5 30min，使荧光染料标记的O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶-生物素与链亲和素结合体-荧光素酶融合蛋白复合物中的荧光素酶融合蛋白与荧光素底物反应产生发光物质，并检测670nm处的发光强度，根据O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶浓度与所述发光强度的相关标准曲线计算出生物素标记的O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶的含量，进而根据公式(I)计算O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶活性；所述O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶活性的定义为在37°C条件下，Imin内能转化生物素标记的O6-甲基鸟嘌呤生成I微摩尔的生物素标记的O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶所需的O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(MGMT)酶量为一个酶活单位(U)。公式(I):z= X IO6其中y=ax+b (y中的a和b分别与公式(I)中a和b相同):a和b均为常数项(根据标准曲线确定)，X为生物素标记的O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶的含量，y为吸光值，z为O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶活性，M为生物素标记的O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶分子量，t为反应时间。进一步，步骤(I)所述生物素标记的O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶的生物素标记方法为将O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶与生物素标记的O6-甲基鸟嘌呤混合，充分混匀后(T40°C水浴0. 5 4h (优选37°C下水浴4h)，反应结束后，将反应液加入14KD的透析袋，用PH为6. 4的TBS缓冲溶液为透析液在4°C下透析，每隔3 5h更换一次透析液，总共更换三次，然后将截留液用凝胶琼脂分子筛过滤，取滤液，即获得生物素标记的O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶；所述凝胶琼脂分子筛为下列之一交联琼脂糖凝胶CL-6B、交联琼脂糖凝胶CL-4B、琼脂糖凝胶-6B或琼脂糖凝胶-4B，更优选交联琼脂糖凝胶CL-6B (美国Invitrogen 公司)。进一步，步骤(2)所述方法为用链亲和素-荧光素酶融合蛋白包被微孔板，再将生物素标记的O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶加入包被后的微孔板中，封闭反应孔，(T40°C下孵育3(T60min，用pH为6 7的TBS缓冲溶液洗板，再加入荧光染料标记的O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶抗体与pH为6 7的TBS缓冲溶液的混合液，(T40°C下孵育3(T60min，用pH为6 7的TBS缓冲溶液洗板，最后向微孔板中加入0. f 0. 5mol/L的荧光素底物缓冲溶液，4 30°C下静置5 30min，检测670nm处(荧光染料Cy6的吸收波长本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种O6？甲基鸟嘌呤？DNA甲基转移酶活性检测方法，其特征在于所述方法为：（1）将O6？甲基鸟嘌呤？DNA甲基转移酶与生物素标记的O6？甲基鸟嘌呤反应，获得生物素标记的O6？甲基鸟嘌呤？DNA甲基转移酶；（2）将链亲和素？荧光素酶融合蛋白与生物素标记的O6？甲基鸟嘌呤？DNA甲基转移酶在0~40℃孵育30~60min，使链亲和素？荧光素酶融合蛋白中的链亲和素与生物素标记的O6？甲基鸟嘌呤？DNA甲基转移酶中的生物素结合，形成O6？甲基鸟嘌呤？DNA甲基转移酶？生物素与链亲和素结合体？荧光素酶融合蛋白复合物，再加入荧光染料标记的O6？甲基鸟嘌呤？DNA甲基转移酶抗体，0~40℃孵育30~60min，使荧光染料标记的O6？甲基鸟嘌呤？DNA甲基转移酶抗体与O6？甲基鸟嘌呤？DNA甲基转移酶？生物素与链亲和素结合体？荧光素酶融合蛋白复合物一端的O6？甲基鸟嘌呤？DNA甲基转移酶结合，形成荧光染料标记的O6？甲基鸟嘌呤？DNA甲基转移酶？生物素与链亲和素结合体？荧光素酶融合蛋白复合物，然后再加入荧光素底物，4~30℃下静置5~30min，使荧光染料标记的O6？甲基鸟嘌呤？DNA甲基转移酶？生物素与链亲和素结合体？荧光素酶融合蛋白复合物中的荧光素酶融合蛋白与荧光素底物反应产生发光物质，检测670nm处的发光强度，根据O6？甲基鸟嘌呤？DNA甲基转移酶浓度与所述发光强度的相关标准曲线计算出生物素标记的O6？甲基鸟嘌呤？DNA甲基转移酶的含量，进而根据公式（1）计算获得O6？甲基鸟嘌呤？DNA甲基转移酶活性；所述O6？甲基鸟嘌呤？DNA甲基转移酶活性的定义为：在37℃条件下，1min内能转化生物素标记的O6？甲基鸟嘌呤生成1微摩尔的生物素标记的O6？甲基鸟嘌呤？DNA甲基转移酶所需的O6？甲基鸟嘌呤？DNA甲基转移酶酶量为一个酶活单位；公式（1）：z=[(y？b)/aMt]×106其中y=ax+b：a和b均为常数项，x为生物素标记的O6？甲基鸟嘌呤？DNA甲基转移酶的含量，y为吸光值，z为O6？甲基鸟嘌呤？DNA甲基转移酶活性，？M为生物素标记的O6？甲基鸟嘌呤？DNA甲基转移酶分子量，t为反应时间。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：陈灿玉，梁媛媛，吕常庆，张现侠，黄志坚，章鹏飞，
申请(专利权)人：杭州师范大学，
类型：发明
国别省市：
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