本发明专利技术公开了一种检测泰乐菌素(TYL)和替米考星(TIL)的时间分辨荧光免疫分析试剂盒及其检测方法。所述检测泰乐菌素(TYL)和替米考星(TIL)的时间分辨荧光免疫分析试剂盒由多孔包被板、缓冲液、去碳霉糖泰乐菌素(DES)标准、抗DES的抗体冻干品、铕标记的兔抗鼠抗体、洗涤液和增强液所组成。所述检测泰乐菌素(TYL)和替米考星(TIL)的时间分辨荧光免疫分析试剂盒的检测方法包括下列步骤：a、免疫原的制备；b、包被原的制备；c、单克隆抗体的制备；d、样品的前处理及检测。本发明专利技术检测方法不需要昂贵的仪器，检测时间短、平均回收率高、样品前处理简单、能现场操作检测，应用广泛，同时具有检测特异性强、批内和批间误差小、灵敏度高和操作简单快速准确廉价，且特别适于大批量样品的检测等优点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种检测泰乐菌素(TYL)和替米考星(TIL)的时间分辨荧光免疫分析(TR-FIA)检测试剂盒及其检测方法，属于时间分辨荧光免疫分析(TR-FIA)
，用于动物源性食品中泰乐菌素和替米考星药物残留量的检测。
技术介绍
泰乐菌素(TYL)和替米考星(TIL)半合成大环内酯类畜禽专用抗生素，具有很强的抗菌活性，耐药性低，抗菌谱广，对所有的革兰氏阳性菌和部分革兰氏阴性菌、霉形体、螺旋体等均有抑制作用，尤其是对多种支原体及螺旋体也具有很强的抑制作用。在畜牧生产上，泰乐菌素(TYL)还用作饲料添加剂，促进动物生长。近年来，由于动物疾病流行，泰乐菌素(TYL)和替米考星(TIL)在畜牧兽医上应用最多的药物，在兽用的抗生素中占有重要的地位。在生产中，由于不合理的使用剂量和不遵守休药期造成泰乐菌素(TYL)和替米考星(TIL)残留，其残留对消费者可产生毒性作用。我国和欧盟分别对泰乐菌素(TYL)和替米考星(TIL)在组织中残留也制定了最高残留限量(MRL)。为了控制泰乐菌素和替米考星残留，保障消费者健康，有必要建立ー种快速、有效的残留检测方法对其残留进行监測。目前在动物性食品中泰乐菌素(TYL)和替米考星(TIL)的分析检测方法有很多，包括高效液相色谱法(HPLC)、液质连用(LC-MS)、气质连用(GC-MS)和ELISA。仪器检测主要存在仪器购置费用昂贵、样品前处理复杂、程序繁琐费吋、检测费用高、不能现场操作等缺陷，其应用受到一定限制。而时间分辨荧光免疫分析法(TR-FIA)由于其特异性强、灵敏度高、操作简单、廉价，且特别适于大批量样品的检测等优点而越来越被人们所重视和采用。目前还没有针对泰乐菌素(TYL)和替米考星(TIL)残留检测的时间分辨荧光免疫分析法的专利和文献报道。
技术实现思路
为解决以上技术问题，本专利技术的目的之ー在于提供一种检测动物可食性组织中泰乐菌素(TYL)和替米考星(TIL)残留的时间分辨荧光免疫分析试剂盒。本专利技术的目的之ニ在于提供ー种快速简便地检测动物可食性组织中泰乐菌素和替米考星残留的时间的分辨荧光免疫分析试剂盒的检测方法，用于定量或定性地检测动物源性食品中泰乐菌素(TYL)和替米考星(TIL)残留量。本专利技术目的之一是这样实现的检测泰乐菌素(TYL)和替米考星(TIL)的时间分辨荧光免疫分析试剂盒，其关键在于由多孔包被板、缓冲液、去碳霉糖泰乐菌素(DES)标准品溶液、抗DES的抗体冻干品、铕标记的兔抗鼠抗体、洗涤液和增强液所组成。 本专利技术目的之ニ是这样实现的检测泰乐菌素(TYL)和替米考星(TIL)的时间分辨荧光免疫分析试剂盒的检测方法，包括免疫原、包被原和单克隆抗体的制备以及样品前处理及检测，其关键在于a、免疫原的制备将半抗原去碳霉糖泰乐菌素(DES)与牛血清白蛋白(BSA)偶联，得到免疫原(DES-BSA)；b、包被原的制备将半抗原去碳霉糖泰乐菌素(DES)与卵清蛋白(OVA)偶联，得到包被原(DES-OVA)；C、单克隆抗体的制备(I)用步骤a的免疫原(DES-BSA)免疫小鼠，通过杂交瘤技术，得到分泌抗DES的单克隆抗体的杂交瘤细胞株；(2)以体内诱生腹水法大量制备抗体，使用Protein G柱进行纯化，获得抗DES的单克隆抗体IgG，该抗体与TYL和TIL有很高交叉反应； (3)用步骤b的包被原包被48或者96多孔包被板；d、样品的前处理及检测取包被有包被原(DES-OVA)的多孔包被板，加入50 ill的TYL或TIL到各自的微孔中，加50 ill以缓冲液稀释的抗DES抗体，25°C 37°C振荡0. 5 I小时，洗涤液洗三次，加以缓冲液稀释的100 ill Eu3+-兔抗鼠抗体，25 °C 37°C振荡0. 5 I小时，用洗涤液洗六次，加200 u I增强液振荡5分钟后测量荧光强度cps，根据标准曲线计算样品中的TYL或TIL含量。上述的固相载体是多孔包被板，采用48或者96孔的多孔包被板作为固相载体。本专利技术主要采用时间分辨荧光免疫分析方法来检测TYL和TIL。采用时间分辨荧光免疫分析法的技术主要有两个方面第一，特异性单抗隆抗体制备，用偶联的免疫原免疫原免疫小鼠，通过杂交瘤技术，得到分泌抗DES的单克隆抗体的杂交瘤细胞株；以体内诱生腹水法大量制备抗体，使用Protein G柱进行纯化，获得抗DES的单克隆抗体IgG。第二，Eu3+标记抗体的制备。本专利技术测定方法测定的基础是标记免疫反应。包被有DES-OVA的多孔包被板，加入测试样品到各自的微孔中，再加入抗DES抗体，振荡反应，游离的TYL或TIL与微孔板上的DES-OVA竞争抗DES抗体，洗涤液洗涤，没有连接的TYL或TIL抗体在洗涤步骤中被除去。加入Eu3+-兔抗鼠抗体，进行标记免疫反应，再用洗涤液洗涤，反应后没有连接的Eu3+-兔抗鼠抗体在洗涤步骤中被除去。加增强液振荡后，在紫外光的激发下发射很强的荧光，用时间分辨荧光仪测定其荧光强度cps，荧光强度与样品中的浓度成反比，对照标准曲线即可确定样品中TYL和TIL的量。有益效果本专利技术检测方法不需要昂贵的仪器，检测时间短、平均回收率高、样品前处理简单、能现场操作检测，应用广泛，同时具有检测特异性强、批内和批间误差小、灵敏度高和操作简单快速准确廉价，且特别适于大批量样品的检测等优点。附图说明图I为本专利技术的TR-FIA标准曲线图。具体实施例方式实施例I、免疫原与包被原制备本专利技术免疫原(DES-BSA)和包被原(DES-OVA)合成方法。称取0_羧甲基羟胺半盐酸盐21. 9mg、碳酸氢钠8. 4mg溶解于三蒸水4mL中。将上述液逐滴加入到154mg DES溶解于4mL甲醇中配制得到的DES溶液中，室温磁力搅拌反应3h。反应后，减压旋转蒸发至含少量水，加入二氯甲烷4mL、无水乙醇2mL重新溶解，加入无水硫酸钠5g，振摇后静置过夜。过滤后，60°C减压旋转。称取上述蒸干物44. 2mg、N, N- 二环已基碳二亚胺(DCC) 12. 4mg、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS) 6. 9mg溶解于N，N- 二甲基甲酰胺(DMF) 3mL中，室温下磁力搅拌反应12h。将上述反应液逐滴加入IlOmg BSA溶解于0. lmol/L磷酸钠缓冲液(pH8. 0)配制得到的17mL的BSA溶液中，边加边搅拌，置室温下磁力搅拌反应过夜。离心后取上清，4°C生理盐水中透析3天，每天更换透析液2次，即得偶联物DES-BSA。2000rpm离心5mim后,取上清液分装，冷冻干燥后，_20°C冰箱保存。在上述反应中，将BSA换成OVA后，得到反应偶 联物DES-0VA，该偶联物作为TR-FIA检测时作为包被原使用。2、单克隆抗体制备2. I动物免疫用步骤I制备的免疫原分别免疫6周龄雌性Balb/c小鼠，每只小鼠的免疫剂量为100 u g/0. 2mL。首次免疫，用无菌0. 01mol/L pH7. 4PBS溶解免疫原(DES-BSA)，再与等量弗氏完全佐剂混合，完全乳化，颈背部皮下分2 3点注射；加强免疫，用0. 01mol/L pH7. 4PBS溶解免疫原与等量弗氏不完全佐剂混合，充分乳化，小鼠腹腔注射。每次间隔14 21天，第3次免疫后7 10天开始对免疫小鼠尾静脉采血，收集血清,用本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测泰乐菌素和替米考星的时间分辨荧光免疫分析试剂盒，其特征在于由下列组分组成：48或90孔包被板抗DES的抗体冻干品DES标准品溶液铕标记的兔抗鼠抗体缓冲液洗涤液增强液所述DES标准品溶液浓度为0ng/mL，0.01ng/mL，0.025ng/mL，0.1ng/mL，0.25ng/mL，1ng/mL，2.5ng/mL，10ng/mL，25ng/mL，100ng/mL系列浓度。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：乐涛，徐建，何红秋，牛小东，陈雍，秦建波，王玉，段小炼，
申请(专利权)人：重庆市科学技术研究院，
类型：发明
国别省市：
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