一种肝吸虫抗体IgG4生物素-亲和素酶联免疫检测试剂盒及其检测方法，属于寄生虫病免疫检测领域。本发明专利技术提供一种基于检测抗肝吸虫抗原特异性抗体IgG4的肝吸虫感染检测试剂盒及检测方法，可以区分肝吸虫感染患者与非肝吸虫感染患者。本试剂盒以肝吸虫抗原特异性IgG4为检测靶标，提高肝吸虫病检测方法的特异性；采用生物素-亲和素信号放大系统，可以增强酶联免疫检测方法的信号强度，提高了肝吸虫病检测方法的敏感性。与常规检测总IgG方法相比，本发明专利技术具有更好的特异性、敏感性与检测效能，有更好的临床应用价值。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及，属于寄生虫病免疫检测领域。
技术介绍
肝吸虫病是严重危害人体健康的一种人兽共患病，由华支睾吸虫、麝猫后睾吸虫和猫后睾吸虫等引起，主要分布于远东，如中国、日本、朝鲜、越南和中南亚国家。我国除青海、宁夏、新疆、内蒙古、西藏等尚无报道外，已有24个省、市、自治区有不同程度流行，人群感染率在1% 30%之间。而保虫宿主动物感染的地区范围更广，感染率与感染度多比人体 感染高，对人群的感染具有潜在的威胁。我国的肝吸虫病主要是华支睾吸虫感染所致，至少已有2300年以上的流行历史。由于肝吸虫寄生于人的肝胆管内，其占位性机械挤压作用和排泄分泌物的长期刺激作用所引起的肝、胆组织炎性病变，可引起严重的肝脏功能损害，甚至癌变。一些地区长期以来形成的食生或半生淡水鱼和虾的饮食习惯，是引发肝吸虫病的重要原因，我国肝吸虫病的流行呈东高西低趋势，主要流行于广东、广西、黑龙江、吉林、江苏等省。经过50多年的积极防治，我国肝吸虫病的防治工作取得了显著的成绩，各地区人群感染率均有不同程度的下降。但随着我国经济社会的发展，生活水平的提高，人们开始追求饮食方式的多样化，生鱼片、火锅和烧烤等饮食方式又重新流行，进食未完全煮熟的鱼制品，或居民烹饪生鱼时不注意厨具的卫生等均会导致肝吸虫病的发生。肝吸虫病的发病率又有上升之势，全年肝吸虫病的发病人数可高达1000-1500万，是当前我国最严重的食源性寄生虫病之一，严重危害我国人民的健康和社会经济发展。肝吸虫因寄生在宿主的胆道中，临床症状不明显，由于缺乏特异性症状和体征，给临床诊断带来了一定的困难。华支睾吸虫病的诊断主要依靠实验室诊断。目前实验室诊断方法主要有如下几种 病原学检测 (I)粪便查虫卵法，主要有盐酸乙醚离心沉淀法，细筛定量透明法，小杯稀释计数法，检测病人粪便中是否存在肝吸虫虫卵。由于肝吸虫虫卵小，排量少，在粪便中的分布不均，容易漏检，尤其是早期感染者阳性率低。(2)十二指肠引流液查虫卵法，胆汁中含虫卵较多，阳性率高，但只适合于部分住院病人检查。病原学检测法具有确诊价值，但因操作复杂，不易被检验人员及病人所接受，易漏检，难以满足应用的需要。B超检测 肝吸虫寄生于肝胆管中，引起肝实质、肝胆管及胆囊的组织病变，如肝组织硬化，肝胆管、胆囊壁组织增厚，纤维化，引起胆道及胆囊扩张。在B超及CT检测时出现不同的组织病变特征，表现为肝脏型，肝实质点状回声增强，增粗，有短棒状、索状或网状回声，肝内光点密集不均匀；胆管型，胆管扩张，管壁粗厚，回声增强，扩张的胆管内有点状、索状、斑块状或线形回声；胆囊型，胆囊壁增厚、粗糙，囊内有点状、棒状、索状、飘带状、条形或斑块形回声，有时伴有小结石或胆泥；混合型，可同时出现上述2种以上类型。由于其它肝胆管病变同样可以出现类似病变体征，B超检测没有特异性，只能作为临床诊断的一个辅助手段。CT 检测 患者均有不同程度的肝内弥漫性胆管扩张，多为肝被膜下小胆管呈囊状或杵状扩张，近肝门侧肝内胆管向被膜侧均匀扩张。少数病例的胆囊内可见团块状或不规则似软组织密度的条状物漂浮在胆汁中，个别病例胰管轻度扩张。CT检测可作为临床诊断的参考。免疫学检测 肝吸虫的排泄分泌物可以刺激宿主免疫系统，产生抗肝吸虫抗原免疫反应。检测肝吸虫抗原特异性免疫反应或免疫反应的产物，如肝吸虫抗原特异性抗体IgG(IgGl、IgG2、IgG3和IgG4亚型)具有辅助诊断价值。常用的方法有皮内试验，是检测肝吸虫感染诱导的抗肝吸虫抗原变态反应，曾经是一种常用的肝吸虫感染筛查方法，但因存在假阳性，使用中可 能会引起过敏反应，存在生物安全风险，现已被停止使用。抗体检测试验，有间接血凝试验、对流免疫电泳试验、酶联免疫吸附试验、间接荧光抗体试验等均是检测肝吸虫感染刺激产生的抗肝吸虫抗原抗体IgG，由于这些方法均使用粗制肝吸虫成虫抗原，但检测病人结果出入较大，且与其它寄生虫感染(尤其是肺吸虫、血吸虫及旋毛虫类感染)有较明显的交叉反应，不能用作确诊，仅作为流行病学调查初筛之用。为了提高肝吸虫抗体检测的特异性，人们发展了多种重组抗原，如Cs7P、Cs28CP、Cs26GST、Cs28GST,现场研究其用于检测肝吸虫病人血清抗体IgG的敏感性分别是 r7P(47. 3%)、r28CP(30. 9%)、r26GST(21. 8%)和 r28GST(14. 5%)，特异性分别是 94. 5%、96. 7%,94. 5%和98. 9%，显示纯化重组抗原用于肝吸虫病的诊断具有高度的特异性，但敏感性太低，不能满足应用的需要。本专利技术的研究结果表明，以肝吸虫成虫抗原检测肝吸虫抗体IgG4具有高度的特异性，达到98. 2%，可以弥补检测总IgG抗体特异性不足的缺点，但其不足之处在于敏感性偏低，只有86%。进一步采用亲和素-生物素信号放大方法，可以将肝吸虫抗体IgG4检测方法的敏感性提高到90%，特异性仍保持在98. 2%，诊断效率达到96. 3%，可满足肝吸虫病临床诊断的需要。
技术实现思路
本专利技术提供一种检测肝吸虫抗原特异性抗体IgG4的生物素-亲和素酶联免疫检测试剂盒及检测方法，可以提高肝吸虫病免疫学诊断的敏感性、特异性。为达到上述目的，本专利技术采用的策略如下 肝吸虫感染人体过程中，其排泄分泌抗原刺激人体免疫系统产生一组抗肝吸虫抗原的抗体IgG，其中包括肝吸虫抗原特异性的抗体IgG4。肝吸虫抗原特异性抗体IgG4的特征是当患者体内有肝吸虫存在时，其血清中肝吸虫抗原特异性抗体IgG4维持一个较高水平。当患者经过有效治疗清除体内肝吸虫时，其血清中肝吸虫抗原特异性抗体IgG4水平迅速下降，呈抗原依赖性。检测患者血清中是否存在抗肝吸虫抗原特异性IgG4抗体可以判断是否存在肝吸虫感染，具有诊断与疗效考核价值。抗肝吸虫抗原特异性抗体IgG4具有高度的特异性，它与其它吸虫类寄生虫抗原之间的交叉反应率低，以肝吸虫抗原特异性抗体IgG4为检测靶标可以提高诊断方法的特异性。为提高肝吸虫抗体抗原特异性抗体IgG4的检测敏感性，本专利技术在构建IgG4酶联免疫检测方法时采用了生物素-亲和素信号放大系统，可使检测方法的信号增强10倍以上。肝吸虫抗原特异性抗体IgG4检测方法(生物素-亲和素酶联免疫法)具有高度的特异性和敏感性。本专利技术的技术方案一种肝吸虫抗原特异性抗体IgG4检测试剂盒，由包被有肝吸虫成虫抗原的酶标条1，生物素标记的抗人IgG4特异性单克隆抗体2，辣根过氧化物酶标记的链亲和素3，显色液A 4，显色液B 5，肝吸虫抗体IgG4阳性对照品6，肝吸虫抗体IgG4阴性对照品7，样品稀释液8，抗体稀释液9，浓缩洗涤液10，反应终止液11和外包装盒与说明书12组成。本专利技术提供一种肝吸虫成虫抗原的制备方法，具体地将肝吸虫虫体用生理盐水反复洗涤数次，洗尽肝吸虫虫体表面的附着物，直到洗涤液完全变澄清。用玻璃匀浆器在冰上将洗涤后肝吸虫虫体匀浆，加入蛋白酶抑制剂PMSF至终浓度为1禮，置于_80°C冰箱，反 复冻融后超声破碎后，高速离心，上清液即为肝吸虫成虫可溶性抗原。本专利技术提供一种包被有肝吸虫成虫抗原的酶标条的制备方法。具体如下用PH9. 6碳酸缓冲包被液将肝吸虫成虫抗原稀释成O. 5-10 μ g/mL的溶液，按每孔100 μ L的量包被酶标条，4°本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种肝吸虫抗原特异性抗体IgG4检测试剂盒，其特征在于由包被有肝吸虫成虫抗原的酶标条（1），酶标条（1）为96孔微孔板，浓度为1μg/孔；生物素标记的抗人IgG4特异性单克隆抗体（2），100μL×1瓶，工作浓度为1︰5000稀释；辣根过氧化物酶标记的链亲和素（3），100μL×1瓶，工作浓度为1︰5000稀释；显色液A（4），5mL×1瓶，市售品；显色液B（5），5mL×1瓶，市售品；肝吸虫抗体IgG4阳性对照品（6），100μL×1瓶，抗肝吸虫的抗体IgG，浓度为1μg/mL；肝吸虫抗体IgG4阴性对照品（7），100μL×1瓶，纯化的健康人IgG，浓度为1μg/mL；样品稀释液（8），12mL×1瓶，含2%BSA的PBST；抗体稀释液（9），25mL×1瓶，含2%BSA的PBST；浓缩洗涤液（10），50mL×1瓶，工作浓度为1︰20稀释；反应终止液（11），6mL×1瓶，2M？H2SO4；和外包装盒与说明书（12）组成；所述肝吸虫成虫抗原的制备：将肝吸虫虫体用生理盐水反复洗涤数次，洗尽肝吸虫虫体表面的附着物，直到洗涤液完全变澄清；用玻璃匀浆器在冰上将洗涤后肝吸虫虫体匀浆，加入蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟PMSF至终浓度为1mM，置于？80℃冰箱，反复冻融后超声破碎后，4℃条件下高速离心，上清液即为肝吸虫成虫可溶性抗原，分装后于？？80℃保存备用；包被有肝吸虫成虫抗原的酶标条（1）的制备：用pH9.6碳酸缓冲包被液将肝吸虫成虫抗原稀释成0.5？10μg/mL的溶液，按每孔100μL的量包被酶标条，4℃放置过夜后，将酶标条孔的包被液倒出，用稀释洗涤液洗板三次，再用牛血清白蛋白封闭液进行封闭2h，倒去封闭液后用稀释洗涤液洗板三次，真空抽干，4℃储存备用；生物素标记的抗人IgG4特异性单克隆抗体（2）的制备：（a）将分泌抗人IgG4单克隆杂交瘤细胞注射到小鼠体内，产生腹水；（b）收集腹水，采用Protean？A亲和层析法纯化抗人IgG4特异性单克隆抗体；（c）将单克隆抗体与活化的生物素混合进行标记，透析去除未结合的生物素，得到生物素标记的抗人IgG4特异性单克隆抗体；辣根过氧化物酶标记的链亲和素（3）的制备：（d）辣根过氧化物酶HRP在过碘酸钠NaIO4作用下，使HRP分子上的糖基氧化成醛基，透析去除化学试剂；（e）加链亲和素Streptavidin，HRP醛基与链亲和素的氨基共价结合，形成Streptavidin？HRP结合物；显色液A（4）为市售品；显色液B（5）为市售品；？肝吸虫抗体IgG4阳性对照品（6），由纯化的粪检虫卵阳性的肝吸虫病人抗体IgG配制而成，用本试剂盒进行检测其OD450nm吸光值大于0.5；肝吸虫抗体IgG4阴性对照品（7）：由纯化的粪检确定为非肝吸虫感染的健康人群抗体IgG配制而成，使用本试剂盒进行检测其OD450nm吸光值小于0.1；样品稀释液（8）为含有牛血清白蛋白、Tween？20的磷酸缓冲液；抗体稀释液（9）为含有牛血清白蛋白、Tween？20的磷酸缓冲液；浓缩洗涤液（10）为含Tween？20的磷酸缓冲液；反应终止液（11）为硫酸。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：余传信，王玠，沈双，宋丽君，殷旭仁，许永良，
申请(专利权)人：江苏省血吸虫病防治研究所，
类型：发明
国别省市：
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