本发明专利技术涉及生物技术领域的干细胞研究，具体涉及AP-1家族蛋白c-Jun截断型诱导多能性干细胞的方法及其应用。本发明专利技术的技术方案为提供一种c-Jun的N端缺失与多能干细胞诱导因子联合使用在诱导多能性干细胞过程中的应用，所述c-Jun的N端缺失为AP-1家族蛋白c-Jun的170位氨基酸至334位氨基酸的一系列截短的氨基酸序列或其对应的核酸序列。本发明专利技术在诱导多能性干细胞的过程中使用了AP-1家族蛋白的c-Jun蛋白的N端截短型，提供了一种高效率的重编程诱导体系，替代核心重编程因子的小分子或基因，将对揭示核心重编程因子在重编中的功能起到推动作用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
的干细胞研究,具体涉及AP-I家族蛋白C-Jun N端缺失诱导多能性干细胞的方法及其应用。
技术介绍
AP-I家族是一类细胞响应外界信号包括生长因子、细胞因子和胞外压力的转录激活蛋白。结构上由不同的亚基组成同源或异源二聚体。这些亚基包括Jun、Fos和ATF。每个亚基上均有一个亮氨酸拉链结构，两两形成与DNA结合的锌指模块。ES细胞及胚胎干细胞是一中在囊胚的内细胞团中分离出的具有体外无限增殖、自我更新和多向分化的特性的细胞。无论在体外还是体内环境，ES细胞都能被诱导分化为机体几乎所有的细胞类型。鉴于ES细胞的体外无限增殖和多分化潜能，其在再生医学领域具 有广阔的应用前景。2006年，日本科学家Yamanaka及其同事用四个转录因子(0ct4, KLF4, Sox2,c-Myc)成功的将小鼠的成纤维细胞重编程为胚胎干细胞，这一技术被称为诱导多能性干细胞(iPS)技术。其后，人及其他物种如大鼠，猴，猪的成纤维细胞也被成功的重编程，这项技术被认为是再生医学中最为重要的突破。近年来，iPS技术发展迅速，首先是四个转率因子中c-Myc被证明是非必须的，尽管去除c-Myc后，重编程效率变得极低；其次，一系列促进重编程的小分子化合物被发现，如组蛋白去乙酰化酶抑制剂VPA、TSA，丁酸钠，DNA甲基化酶抑制剂5-AZA ；TGF-^抑制剂A83-01及SB431542，组蛋白甲基转移酶抑制剂BIX01294，维生素C (抗坏血酸)等。这些小分子化合物的发现，极大的加速了 iPS进程，将重编程效率从起初的约O. 01%提高到接近1%的水平。此外，无血清以及化学成分限定培养条件的采用，将三因子的重编程效率提高到10%左右，同时也解决了血清培养体系中血清批次差异导致的实验重复性差的问题，为重编程研究提供了非常好的平台。然而，对转录因子诱导重编程过程机理的揭示进展依旧缓慢。寻找能替代核心重编程因子的小分子或基因，将对揭示核心重编程因子在重编中的功能起到推动作用。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种AP-I家族蛋白的c-Jun基因的截短型诱导多能性干细胞的方法及应用。本专利技术的技术方案为提供一种c-Jun的N端缺失与多能干细胞诱导因子联合使用在诱导多能性干细胞过程中的应用，所述c-Jun的N端缺失为AP-I家族蛋白c-Jun的170到274位氨基酸到末端334位氨基酸的截短或其对应的核酸序列。优选的，上述多能干细胞诱导因子为Klf4、Sox2、0ct4。优选的，上述多能干细胞诱导因子为Klf4、Sox2、c-Myc。优选的，上述多能干细胞诱导因子为Klf4、0ct4、c-Myc。优选的，上述多能干细胞诱导因子为Klf4、Sox2。本专利技术的另ー个技术方案为提供ー种C-Jun的N端缺失诱导多能性干细胞的方法a、将含有供体C-Jun蛋白氨基酸序列的170到274位氨基酸到末端334位氨基酸对应的核酸序列克隆到表达载体上；b、用步骤a所得表达载体与多能干细胞诱导因子感染供 体体细胞使其重编程为多能干细胞。优选的，所述步骤a具体为将含有供体C-Jun蛋白氨基酸序列的254-334，274-334，170-334位氨基酸片段对应的核酸序列克隆到表达载体上。优选的，上述方法的多能干细胞诱导因子为Klf4、SoX2、0ct4。优选的，上述方法的多能干细胞诱导因子为Klf4、Sox2。优选的，上述方法的供体体细胞为小鼠成纤维细胞。本专利技术在诱导多能性干细胞的过程中使用了 AP-I家族蛋白的C-Jun蛋白的N端截短型，提供了一种高效率的重编程诱导体系，替代核心重编程因子的小分子或基因，将对掲示核心重编程因子在重编中的功能起到推动作用。c-Jun蛋白的N端截短型包括170位氨基酸至334位氨基酸等一系列截短，尤其包括170到274位到末端334位氨基酸的一系列截短型。如图2所示170-334，250-334、274-334片段对OKS诱导的重编程具有促进作用，其中170-334,250-334片段则对OKS诱导的重编程具有明显的促进作用。附图说明图I是小鼠c-Jun蛋白全长和不同截短型的结构图。根据NCBI上小鼠c-Jun的蛋白序列全长和结构域信息，设计不同的引物，采用常规分子克隆的方法，克隆出图示中不同氨基酸的序列的多妝片段用于实验。其中1-334多妝片段命名为c-Jun-FL ； 1-256多妝片段命名为c-Jun(-bZIP)，170-334片段命名为c-Jun_DN。将克隆的片段用合适的限制性内切酶克隆到逆转录病毒载体PMXS上，进行目的片段的表达。图2是在OKS三因子重编程模型下，c-Jun蛋白全长或不同截短型与空载相比的重编程效率比较图。以OKS和空载病毒感染0G2胚胎成纤维细胞为对照，分别用OKS及所示c-Jun基因全长或不同截短型病毒感染0G2胚胎成纤维细胞。感染后在含血清的mES培养基中进行诱导培养，在合适的天数在荧光显微镜下计算GFP阳性的荧光克隆数。将各片段得到的重编程克隆数除以空载状态下的重编程克隆数，得到全长或各截短片段对重编程效率的影响。图3是c-Jun (-ZIP)和C-Jun-DN对三因子重编程效率的影响图。三因子SKO和所示病毒感染0G2小鼠胚胎成纤维细胞后，在血清或无血清培养体系iSFl中连续培养，每天更换培养基。在合适的天数，通过荧光显微镜计算绿色荧光克隆数，以三因子感染组荧光克隆数为參照，计算各实验组的相对重编程效率。图4是C-JunDN对不同重编程因子的取代效果图。分别用所示病毒感染0G2小鼠胚胎成纤维细胞，感染后在无血清培养体系iSFl中连续培养，每天更换培养基。在合适的天数，通过荧光显微镜计算绿色荧光克隆数。分析C-JunDN对Sox2，Klf4和0ct4的取代作用。K Klf4 ；S Sox2, M c-Myc, 0 :0ct4。图5是C-JunDN替代0ct4与klf4及Sox2 —起将小鼠成纤维细胞重编程效果图。分别用所示病毒感染0G2小鼠胚胎成纤维细胞，感染后在无血清培养体系iSFl中连续培养，每天更换培养基。在合适的天数，通过荧光显微镜计算绿色荧光克隆数。K:Klf4;S:Sox2。图6是挑取的SKMJunDN诱导重编程克隆图。所述KSMJunDN为KSM和c-Jun-DN感染的细胞。由SKMJunDN诱导的重编程克隆在显微镜下呈现致密的球体，边缘光泽，形态均一，具有典型的干细胞形态；荧光显微镜下显示出很强的绿色荧光，表明其内源多能性基因0ct4已经激活。AP染色呈阳性，表明克隆表达碱性磷酸酶。图7是SKMJunDN诱导重编程克隆0ct4和Nanog启动子区CpG岛甲基化状态图。将挑取的SKMJunDN诱导重编程克隆培养物提取基因组DNA，采用PCR，用特异性引物将克隆基因组0ct4和Nanog启动子区目的片段分离。采用亚硫酸盐法分析 目的区域CpG岛的甲基化状态。结果表明，挑取的克隆0ct4和Nanog的启动子区均呈现去甲基化状态，与胚胎干细胞类似。黑圈表示CpG岛为甲基化状态，白圈表示CpG岛为去甲基化状态。图8是SKMJunDN诱导重编程克隆表达Sox2，Nanog, Rexl，SSEA-I等多能性分子标记物图。将挑取的克隆种植到饲养层细胞上，用胚胎干细胞本文档来自技高网...
【技术保护点】
c？Jun的N端缺失与多能干细胞诱导因子联合使用在诱导多能性干细胞过程中的应用，所述c？Jun的N端缺失为AP？1家族蛋白c？Jun的170到274位氨基酸到末端334位氨基酸的截短或其对应的核酸序列。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：裴端卿，韩庆凯，刘晶，陈捷凯，韦备，彭梅秀，
申请(专利权)人：中国科学院广州生物医药与健康研究院，
类型：发明
国别省市：
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