底物预诱导制备7α，15α-二羟基雄甾烯酮的方法技术

本发明专利技术公开一种以亚麻刺盘胞菌（Colletotrichumlini）ST-1为菌种，生物合成7α，15α-二羟基雄甾烯酮的发酵工艺方法，其特征在于发酵过程前期先加一定量的底物去氢表雄酮，培养一段时间后再投入底物，这样既能对转化过程的关键酶进行预诱导，又能减少一次性投底物对菌体细胞产生的毒害性，以此能提高产物产量。采用本发明专利技术的发酵工艺合成产物7α，15α-二羟基雄甾烯酮时，底物投料浓度可以达到8g/L(底物重量/发酵液体积)，转化率可以达到90%左右。此方法提供的底物投料方式与一次性投料相比，减小底物对细胞毒害性，能在一定程度上提高产物得率，并且提高底物投料量。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物工程
，具体涉及一种以亚麻刺盘胞菌{CoIletotrichumI ini) Sl-I为菌种发酵过程底物预诱导高效制备7 α，15 α - 二羟基雄甾烯酮的方法。
技术介绍
屈螺酮(DRSP)为醛固酮拮抗剂，具有抗矿物皮质酮活性的作用。它与乙炔雌二醇结合使用构成新型高效单相口服避孕药Yasmin。而7 α，15 α - 二羟基雄甾烯酮则是生产屈螺酮的重要医药中间体，其生产方式主要有传统的化学合成法、半合成法、生物转化法三类。7α，15α-二羟基雄甾烯酮是由去氢表雄酮经过7位和15位的羟化作用生成，如 果该反应通过纯化学方法实现，则需要将近十步的繁琐反应，且反应过程需要大量的有毒试剂等等。生物转化的方法通过微生物将其直接羟化，生产工艺简单，减少了合成步骤、降低了能耗，并大幅削减了污染物的排放，属于先进的清洁生产工艺路线。通过此方法生产，较之化学合成法与半合成法，可大量节省生产成本，并做到绿色环保，在留体的药物的合成中发挥着重要的作用。据相关文献报道，目前已有赤霉菌、亚麻刺盘胞菌等菌株具有去氢表雄酮7α，15α双羟化能力，但其转化能力有限，所以转化工艺的进一步改进是留体生物转化研究的一大问题。亚麻刺盘胞菌是已经报道的能将去氢表雄酮转化为7 α，15 α - 二羟基雄留烯酮的菌株，底物投料浓度为8g/L，转化效率一般为85%左右。本专利技术则是在原有的发酵工艺上作一定的改进，转化率提高了 4. 5%左右。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种用亚麻刺盘胞菌(Colletotrichum lini)ST_l转化去氢表雄酮生成7 α，15 α - 二轻基雄留烯酮的工艺,在发酵初期投加一定浓度的底物去氢表雄酮，再补加底物继续转化，这样既能对转化过程的关键酶进行预诱导，又能减小一次性投料留体底物对细胞造成的毒害性，以此提高7 α，15 α - 二羟基雄留烯酮产率的方法。该菌于2012年4月24日保藏在位于北京市朝阳区北辰西路I号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 6051，分类命名为亚麻刺盘胞菌(Colletotrichum lini)。一种在亚麻刺盘胞菌生物转化去氢表雄酮发酵过程中流加过氧化氢高效制备7 α, 15 α- 二羟基雄留烯酮的方法，具体工序如下 (I)亚麻刺盘胞菌IColletotrichum lini) ST-I按常规方法进行活化培养,将该培养液涂布到PDA培养基上，将接种菌种的斜面置于30°C的恒温培养箱中，培养4飞天，得到成熟的孢子。(2)种子培养将步骤(I)的PDA固体培养基上成熟孢子接种于已灭菌的装有IOOmL种子培养基的500mL摇瓶中，在28 30°C，20(T220rpm摇床上培养3 4天，得到适于接种的种子培养液。(3)发酵培养将步骤(2)中培养好的种子培养液以8% 10% (v/v)的接种量接入发酵培养基，装液量为250 mL锥形瓶中装30mL发酵培养基，培养温度为28 30°C，在200 220rpm的转速下培养l(Tl4h，精确称取I. (Γ3. Og/L的底物去氢表雄酮投入菌体培养液，继续发酵培养至24小时，再取适量底物，投入发酵液，使其终浓度为8g/L，在转化温度28 30°C，20(T220rpm的转速下转化48 60h放瓶，即得转化液。(4)产物检测将步骤(3)的转化液取lmL，加入ImL乙酸乙酯，用振荡器震荡lmin，离心取上清，抽提3次，合并抽提液后于真空离心浓缩仪中离心至有白色晶体出现，乙腈复溶晶体并通过O. 22 μ m的有机膜过滤除杂，滤液用HPLC分析，外标法对样品进行定量并计算产物的率。HPLC条件为色谱仪戴安Ultimate 3000 ;色谱柱C18柱；检测器Ultimate 3000 variable wavelength detector ;流动相乙臆水=70:30;流速0.511117/min ;进样量:10 μ L ;柱温:30°C。其中步骤(I)中所述的PDA培养基的成分及配比为土豆20(T500 g/L ;葡萄糖 20 50 g/L;酵母粉2 10 g/L;琼脂粉10 20 g/L ;pH自然，在121°C高压蒸汽下灭菌20min ;步骤(2)所述种子培养基的成分及配比为葡萄糖1(T15 g/L ;豆饼粉8 15g/L ;酵母粉l(Tl5g/L ;玉米浆2 3g/L ;其余为水，pH自然，在121°C高压蒸汽下灭菌20min ;步骤(3)所述发酵培养基的成分及配比为葡萄糖1(T15 g/L ;酵母粉l(Tl5g/L ;玉米浆2 3g/L ;其余为水，pH自然，在121°C高压蒸汽下灭菌20min。本专利技术与原始工艺不同之处在于在发酵过程前期先加一定浓度底物再补加底物进行发酵，采用本专利技术生物转化制备7 α，15 α - 二羟基雄留烯酮时，底物投料浓度可以达到8g/L (底物重量/发酵液体积)，转化率可以达到90%左右。与原有的发酵工艺相比，底物得率有所提高，转化周期相对缩短。附图说明 图I为本专利技术在菌体培养液中转化的高效液相色谱图。图2为不同的底物预诱导时间对产物得率的影响。具体实施例方式下面通过具体实施实例进一步描述本专利技术。实施例I : (I)将接种菌种的斜面置于30°c的恒温培养箱中，培养3天，得到成熟的孢子，将孢子接种于装有IOOmL种子培养基的500mL摇瓶中，在28°C，220rpm摇床上培养4天，得到适于接种的种子培养液。(2)将种子培养液以10%的接种量接入装有30mL发酵培养基的250mL的摇瓶中，以相同条件继续培养24h，得到菌体培养液。(3)准确称取8g/L的底物投入到步骤(2)得到的菌体发酵液中，相同条件下转化60小时放瓶。提取产物进行HPLC分析，得到转化率为83. 79%。实施例2:(I)斜面培养、种子培养以及发酵培养同实施例I。(2)将种子培养液以10%的接种量接入装有30mL发酵培养基的250mL的摇瓶中，培养12h，培养条件28°C，220rpm,然后准确称取2g/L (底物重量/发酵液体积)底物投入菌体液中继续培养12h。(3)准确称取8g/L的底物去氢表雄酮加入到步骤(2)得到的菌体培养液，使底物的投料终浓度为8g/L，继续转化48h放瓶。取发酵液ImL检测，得转化率为89. 95%。实施例3 (I)斜面培养、种子培养以及发酵培养同实施例I。(2)将种子培养液以10%的接种量接入装有30mL发酵培养基的250mL的摇瓶中，培养8h，培养条件28°C，220rpm,然后准确称取2g/L (底物重量/发酵液体积)底物投入菌体液中继续培养16h。 (3)准确称取8g/L的底物去氢表雄酮加入到步骤(2)得到的菌体培养液，使底物的投料终浓度为8g/L，继续转化48h放瓶。取发酵液ImL检测，得转化率为86. 95%。实施例4 (I)斜面培养、种子培养以及发酵培养同实施例I。(2)将种子培养液以10%的接种量接入装有30mL发酵培养基的250mL的摇瓶中，培养15h，培养条件28°C，220rpm,然后准确称取2g/L (底物重量/发酵液体积)底物投入菌体液中继续培养9h。(3)准确称取8g/L的底物去氢表雄酮加入到步骤(2)得到的本文档来自技高网...

【技术保护点】
底物预诱导制备7α，15α？二羟基雄甾烯酮的方法，采用以亚麻刺盘胞菌（Colletotrichum？lini）ST？1为菌种发酵生产7α，15α？二羟基雄甾烯酮的生产工艺，其特征是：以液体种子培养基培养种子，再转接到发酵培养基进行培养，发酵过程初期加入一定量的底物去氢表雄酮进行预诱导，培养一段时间再投加底物继续转化以完成发酵。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：许正宏，付珍珍，朱晓宏，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：