本发明专利技术涉及一种β-内酰胺酶NDM-1的晶体结构，其中，所述β-内酰胺酶NDM-1为所述β-内酰胺酶NDM-1全长蛋白序列的从约40～50位氨基酸至约260～270位氨基酸的编码基因，其中所述晶体三维结构中的原子具有表1中所列的至少40％的原子坐标，或者β-内酰胺酶NDM-1的晶体三维结构中至少40％氨基酸的主链碳骨架的原子结构坐标与表1中的坐标的平均根方差小于或等于1.5埃。本发明专利技术还涉及一种纯化β-内酰胺酶NDM-1的方法以及β-内酰胺酶NDM-1的晶体三维结构在药物筛选及药物设计方面的应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及对超级细 菌新德里金属依赖型￠-内酰胺酶NDM-I进行基因工程改造以获得在大肠杆菌中的高效表达、纯化和结晶的方法，以及超级细菌新德里金属依赖型^ -内酰胺酶NDM-I第47位到第270位氨基酸的三维晶体结构及其在药物筛选及药物设计方面的应用。
技术介绍
超级细菌NDM-I在2010年8月经Lancet杂志特别报道后，引起了全世界广泛的关注，美国3个州和加拿大也出现感染个案；医学界表示，细菌正在蔓延，但未知蔓延速度有多快，呼吁各国设立监控系统，检测入院人士，合力追踪病菌蔓延情况，并呼吁民众注意个人卫生，不要滥用抗生素。至2010年9月，英国有超过70人感染这种NDM-I超级细菌，印度和巴基斯坦的感染人数则超过170人。比利时、荷兰、奥地利、法国、德国、肯尼亚、澳大利亚、日本等国都出现了感染个案。因此，解析NDM-I的三维结构不仅对揭示其复制机制具有重要的科学意义，而且对开发抗NDM-I药物具有重要价值。NDM-1,指的是 New Delhi metalIo-^ -lactamase I (新德里金属-P -内酸胺酶)。这种酶可分解￠-内酰胺环结构，因此可使任何含￠-内酰胺环结构的蛋白质失效。由于目前为止临床最常用的抗生素，包括青霉素与头孢菌素，以及新发展的头霉素类、硫霉素类、单环￠-内酰胺类等其他非典型￠-内酰胺类抗生素，都含有￠-内酰胺环结构，因此携带这种酶的细菌可以使几乎所有抗生素失效(即只要该抗生素含有￠-内酰胺环结构)。超级细菌NDM-I则是指携带编码NDM-I酶的基因的细菌。至今已发现一些克雷伯氏肺炎菌、大肠杆菌和少数鲍曼不动杆菌的菌株携带有此能编码新德里金属-3 -内酰胺酶I的基因，而该基因存在于细菌的质粒(一种容易在细菌间发生基因彳目息交换的环状DNA)上，亦即此基因可以通过基因水平转移以从一个菌株转移到另一个菌株中，使原本对抗生素敏感(没有耐药性)的菌株获得耐药性。最早报道的产NDM-I细菌为肺炎克雷伯菌，于2009年在一位印度裔瑞典尿路感染患者中发现，对所有￠-内酰胺类抗菌药物耐药，对环丙沙星也不敏感，仅对粘菌素敏感，深入研究发现这株细菌携带一种新型金属￠-内酰胺酶，并根据患者可能感染地点命名这种酶为NDM-I，其后还在这名患者粪便中分离到产NDM-I的大肠埃希菌。NDM-I属于B类金属@ -内酰胺酶(MBL)家族，临床分离细菌大多能产生@ -内酰胺酶，已经确定的P-内酰胺酶有数百种；各种酶分子结构和对P-内酰胺类水解能力存在较大差异，一般根据分子结构分为A、B、C、D四大类，其中，A类，C类和D类的￠-内酰胺酶结构上与丝氨酸￠-内酰胺酶类似，通常他们的活性位点具有一个狭窄的纵形沟状结构，在沟的底部形成了一个空腹(氧阴离子袋)，这种疏松的构造容易弯曲，便于结合底物。由于P-内酰胺环上的羰基碳在结合P-内酰胺酶活性部位的丝氨酸时发生了不可逆的反应，结果使其开环，进而引起￠-内酰胺酶的分解。而B类金属￠-内酰胺酶(MBL)在其活性部位大多含有锌离子，因此又称为金属3 -内酰胺酶。其水解底物包括青霉素类、头孢菌素类和碳青霉烯类等，表现为产酶细菌对这些药物广泛耐药。MBLs利用一个二价金属离子，分别与组氨酸或半胱氨酸结合，或同时与二者结合，并与￠-内酰胺类抗生素的羰基碳的酰胺键相互作用，使其发生分解。MBLs主要对青霉素、头孢菌素、碳青霉稀类抗生素发挥作用，但对单内酰环类抗生素无效。MBLs最大特点是可以水解碳青霉烯类等抗生素，而对哌拉西林和氨曲南影响较小，其活性不被克拉维酸等￠-内酰胺酶抑制剂所抑制，但可被乙二胺四乙酸(EDTA)所抑制。 然而，尽管一些P -内酰胺酶抑制剂已经在临床上使用(如三唑巴坦)，但这些均被视为A类P-内酰胺酶抑制剂(如丝氨酸P-内酰胺酶)。因此，临床上仍然缺乏针对MBLs的抑制剂。而蛋白质结构的解析对揭示蛋白质功能具有重大作用。这一结构的揭示也将对其功能研究具有重大意义。
技术实现思路
本专利技术的一个方面，提供了一种将超级细菌新德里金属依赖型￠-内酰胺酶NDM-I进行基因工程改造，以提高其在大肠杆菌中能够得到高效表达、在常温(摄氏37±5°C)下可以较长时间稳定保持内酰胺酶活性的蛋白的方法。本专利技术优选使用大肠杆菌的原核细胞表达系统(但不排除其他的表达系统，如在其他细菌或者其他的真核生物细胞中进行表达)，对以上所述蛋白以GST (谷胱甘肽-S-转移酶)融合蛋白的方式进行表达，并用于蛋白质结晶的方法。本专利技术述及在大肠杆菌中高效获得￠-内酰胺酶NDM-I的表达方法。优选地，本专利技术将￠-内酰胺酶NDM-I进行了基因工程改造，将￠-内酰胺酶NDM-I全长基因进行了截短的研究，提供了一个可以在大肠杆菌中高效表达的方法，该方法包括了氨基端约40 50位氨基酸至约260 270位氨基酸的编码基因，更优选包括约47位至270位氨基酸。根据本专利技术的另一个方面，本专利技术提供了一种纯化P -内酰胺酶NDM-I的方法。将基因工程方法改造过以后的NDM-I基因连接于带有标签的表达性质粒载体中，转化进入大肠杆菌细胞中进行表达、纯化。优选地，其中所述的标签选自GST、Flag-tag、Myc-tag、MBP-tag> His-tag、特异性抗体；所述载体含有选择性标记基因。所述与特异标签识别的方法是通过亲和层析柱进行，所述去掉标签的方法通过用蛋白酶酶解，所述分离纯化蛋白的方法是进一步用凝胶过滤和离子交换层析等方法分离纯化NDM-I蛋白；用凝胶电泳的方法确定蛋白质的纯度。根据本专利技术的另一个方面，本专利技术提供了一种结晶上述得到的NDM-I蛋白的方法，所述的方法包括将NDM-I蛋白浓缩至5-10mg/ml，在4-30摄氏度下用气相扩散法筛选晶体生长条件。根据本专利技术的另一个方面，本专利技术提供了衍射性能良好的NDM-I蛋白质晶体。根据本专利技术的另一个方面，本专利技术提供了超级细菌新德里金属依赖型￠-内酰胺酶NDM-I的三维结构，该结构描述了 NDM-I蛋白的二级结构组成、肽链走向、组织模式以及三维分子构造。其中针对NDM-I晶体进行X射线晶体衍射，得到NDM-I晶体的晶体衍射数据，用所述的蛋白质晶体的衍射数据进一步通过结构解析，构建内酰胺酶NDM-I的三维结构。其中所述P -内酰胺酶NDM-I为所述P -内酰胺酶NDM-I全长蛋白序列的从约40 50位氨基酸至约260 270位氨基酸的编码基因，其中所述晶体三维结构中的原子具有表I中所列的至少40%的原子坐标，或者￠-内酰胺酶NDM-I的晶体三维结构中至少40%氨基酸的主链碳骨架的原子结构坐标与表I中的坐标的平均根方差小于或等于I. 5埃。优选地,其中所述的母体晶体具有P3 (I)空间群，晶胞参数为约a = 40. 7埃，b =40. 7 埃，c = 215. 3 埃，a =旦=90°，Y = 120°。 优选地，其中所述P -内酰胺酶NDM-I由P折叠1，即含Gly47_Ala55的氨基酸区段，^折叠2,即含Leu65-Ser75的氨基酸区段，^折叠3,即含Asp82_Arg85的氨基酸区段，^折叠4，即含Val86-Val89的氨基酸区段，a螺旋1，即含Thr98_Glnl07的氨基酸区段，^折叠5，即含Leull5_Aspll8的氨基酸区本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种β？内酰胺酶NDM？1的晶体结构，其中，所述β？内酰胺酶NDM？1为所述β？内酰胺酶NDM？1全长蛋白序列的从约40～50位氨基酸至约260～270位氨基酸的编码基因，其中所述晶体三维结构中的原子具有表1中所列的至少40％的原子坐标，或者β？内酰胺酶NDM？1的晶体三维结构中至少40％氨基酸的主链碳骨架的原子结构坐标与表1中的坐标的平均根方差小于或等于1.5埃。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：饶子和，杨诚，郭宇，娄智勇，王静，周红刚，牛国君，
申请(专利权)人：天津市国际生物医药联合研究院，
类型：发明
国别省市：
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