一种防治由艰难梭菌所致肠道感染的活菌疫苗及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种防治艰难梭菌毒素A阳性的艰难梭菌所致肠道感染的活菌疫苗，所述疫苗含有胸苷酸合成酶ThyA基因缺陷型重组乳酸链球菌；该疫苗经试验验证安全有效。还公开了上述活菌疫苗的制备方法及其在制备具有防治艰难梭菌毒素A阳性的艰难梭菌所致的肠道感染药物中的用途。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种防治由艰难梭菌所致肠道感染的活菌疫苗及其制备方法和应用，具体涉及一种防治艰难梭菌毒素A阳性的艰难梭菌所致肠道感染的活菌疫苗。
技术介绍
艰难梭菌(clostridium difficile,⑶)是一种革兰氏阳性厌氧芽孢杆菌,是最重要的医院感染的病原体之一。研究表明，临床上约1(T20%的抗生素相关性腹泻和近100%的伪膜性肠炎与此菌有关。艰难梭菌相关性腹湾(Clostridium difficile-associateddiarrhea, CDAD)主要发生于长期服用抗生素者，也可发生于其他影响肠道正常菌群，降低抵抗艰难梭菌定殖的情形，如用抗肿瘤药物、长期住院、免疫缺陷等，特别是那些有免疫功能降低者和/或老年人。CDAD临床表现复杂多样，从无症状携带者到爆发性结肠炎。重症患 者预后差，死亡率高达40%。CDAD的治疗分为抗菌治疗和非抗菌治疗。抗菌治疗中，虽95%的患者对甲硝唑或万古霉素敏感，但5 30%患者停药后易复发，还可造成继发多重耐药菌株感染。非抗菌治疗主要手段之一是采用生态制剂，可作为治疗辅助用药或预防复发。但是，由于抗生素的“无选择性”杀菌作用，使生态菌在CDAD的预防中发挥的作用十分有限。因此，有必要探索新的防治CDAD方法。而有效的疫苗正是防治CDAD最理想的途径和方法。艰难梭菌主要产生两种毒素毒素A和毒素B。毒素B与毒素A基因有一定的同源性，两基因位于C端的重复序列，起结合膜受体作用，N端序列为毒素的酶及毒性作用区。毒素A分子表面结构大部分是由C-末端重复单位构成的，形成了毒素A分子的粘合区域(TxAC314,即14CDTA, 14C_terminal toxin A repeats)。业已证明，针对粘合区域的抗体具有保护作用，可以抑制毒素A的细胞毒性和肠毒性。针对毒素A设计的艰难梭菌疫苗也可以有效地防治A毒素阳性的艰难梭菌感染。国内外对艰难梭菌疫苗研究的技术主要分为以下三类①被动免疫型疫苗如用艰难梭菌菌体或重组毒素经甲醛处理后免疫母鸡，得到蛋黄免疫球蛋白IgY，经纯化后，口服治疗艰难梭菌感染。或者用基因工程的方法表达纯化的针对艰难梭菌毒素的重组单克隆抗体。这一类型疫苗的优点是不仅可预防，还可以作为治疗性疫苗，但成本高，保存运输等不便。②主动免疫型疫苗如将艰难梭菌产毒株培养滤液及菌体分别用福尔马林灭活后，以霍乱毒素作为粘膜佐剂制备的减毒疫苗；还有通过基因重组表达用艰难梭菌毒素A羧基端重复单位作为载体蛋白与其他病源微生物的多糖共价结合构建成疫苗，或者用基因重组技术，在大肠杆菌内表达毒素A与毒素B基因的3'端的重复序列，重组多肽纯化后与多糖结合等基因工程疫苗。这但类疫苗于采用福尔马林处理抗原，或免疫时配合使用佐剂，一些采用侵入性免疫途径(如皮下、腹腔内注射等)，因此，人体应用时不易被患者接受；③口服活菌疫苗，其实也是主动免疫型疫苗的一种。用减毒霍乱弧菌或减毒鼠伤寒杆菌中表达艰难梭菌毒素A羧基端无毒的受体结合区，形成减毒活菌疫苗，通过鼻腔及胃饲活菌，在肺、肠粘膜和血清中产生高滴度的抗毒素A抗体及抗破伤风毒素抗体。这类活菌疫苗的优点是经济、方便，也有较好的免疫保护效果，还可同时做成多介疫苗，但由于目前采用了减毒伤寒菌或霍乱弧菌作为载体菌，于人体应用时其生物安生性值得关注，因而有进一步改进的必要。乳酸链球菌(Streptococcuslactis ；Lactococcus lactis)是一种革兰氏阳性球菌，被认为是一种对人体无害，较为安全的细菌(generally regarded as safe, GRAS)。作为一种食品工业菌，其被广泛应用于乳制品工业。乳链菌近年来被大量用于表达多种生物多肽或蛋白，如表达白介素2 (interleukin 2，IL2)、IL6、ILlO和三叶肽等。由于乳链菌是食品级的细菌，所以重组的乳链菌也被作为一种安全的生物制品的载体。例如，经改造的分泌ILlO的重组乳链菌可以作为活菌口服，直接进入肠道表达ILlO从而抑制炎症反应。乳链菌也被用于口服疫苗的研究工作。如将流产布鲁氏菌(Brucella abortus)的抗原L7/L12与酿胺链球菌(Streptococcus pyogenes)的M6蛋白的膜锚定序列(cell wallanchoring, CffA)连接成融合蛋白表达于乳链菌中,可以使抗原锚定于乳链菌的表面以增加 抗原性，形成抗流产布鲁氏菌感染的食品级的口服活菌疫苗(Food-grade live vaccine)。随着人口老龄化和肿瘤发病率的增加、抗生素等对肠道菌群有影响的药物使用等原因，在临床上艰难梭菌感染率有增加趋势。研究一种新的抗艰难梭菌感染的疫苗是防治艰难梭菌感染的有效手段。但是目前尚无将乳酸链球菌作为表达载体用于艰难梭菌毒素A阳性的艰难梭菌所致肠道感染的活菌疫苗研究中。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的在于提供一种防治艰难梭菌毒素A阳性的艰难梭菌所致肠道感染的活菌疫苗，该活菌疫苗经试验验证安全有效。本专利技术的第二个目的在于提供上述防治艰难梭菌毒素A阳性的艰难梭菌所致肠道感染的活菌疫苗的制备方法，该制备方法具有成本低、可大量制备及工艺简单等优点。本专利技术的最后一个目的在于提供上述上述防治艰难梭菌毒素A阳性的艰难梭菌所致肠道感染的活菌疫苗在制备具有防治艰难梭菌毒素A阳性的艰难梭菌所致的肠道感染药物中的用途。本专利技术的第一个目的是通过如下技术方案来实现的一种防治艰难梭菌毒素A阳性的艰难梭菌所致肠道感染的活菌疫苗，所述疫苗含有胸苷酸合成酶ThyA基因缺陷型重组乳酸链球菌。其中，所述的胸苷酸合成酶ThyA基因缺陷型重组乳酸链球菌通过如下方式获得采用表达分泌型的抗艰难梭菌毒素A的融合蛋白取代乳酸链球菌的胸苷酸合成酶ThyA基因序列。所述的表达分泌型的抗艰难梭菌毒素A的融合蛋白通过以下方式获得将乳酸链球菌分泌型蛋白45基因的信号肽序列SPUsp45、艰难梭菌A毒素C末端重复序列14⑶TA和无毒性破伤风毒素C片段序列TETC，按正确的阅读框用基因工程的方法连接形成表达分泌型的抗艰难梭菌毒素A的融合蛋白。更优选的，所述的表达分泌型的抗艰难梭菌毒素A的融合蛋白通过以下方式获得将乳酸链球菌分泌型蛋白45基因的信号肽序列SPUsp45、艰难梭菌A毒素C末端重复序列14CDTA、无毒性破伤风毒素C片段序列TETC和酿脓链球菌M6蛋白的膜锚定序列CWAM6，按正确的阅读框用基因工程的方法连接形成表达分泌型的抗艰难梭菌毒素A的融合蛋白。其中，乳酸链球菌分泌型蛋白45基因的信号肽序列SPUsp45的核苷酸序列如SEQID NO. I所示，氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示，艰难梭菌A毒素C末端重复序列14⑶TA的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所 示，氨基酸序列如SEQ ID NO. 4所示，无毒性破伤风毒素C片段序列TETC的核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所示，氨基酸序列如SEQ ID NO. 6所示，酿脓链球菌M6蛋白的膜锚定序列CWAM6的核苷酸序列如SEQ ID NO. 7所示，氨基酸序列如SEQ IDNO. 8所示。即结合现有的艰难梭菌感染的疫苗研究技术以及乳酸链球菌在活菌疫苗中应用的技术，本专利技术人采用食品级的乳酸链球菌为抗原蛋本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种防治艰难梭菌毒素A阳性的艰难梭菌所致肠道感染的活菌疫苗，其特征是：所述疫苗含有胸苷酸合成酶ThyA基因缺陷型重组乳酸链球菌。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：陈学清，杨晓强，
申请(专利权)人：广州医学院第一附属医院，杨晓强，
类型：发明
国别省市：