一种检测寡核苷酸与目的基因组的相似性的方法技术

本发明专利技术公开了一种检测寡核苷酸与目的基因组的相似性的方法。本发明专利技术方法，包括如下步骤：1)以目的基因组DNA为模板，用5′末端连接有待测寡核苷酸的随机引物作为引物，进行DNA合成反应，得到其中一条链的5’末端带有所述寡核苷酸A的双链DNA，记作产物I；2)以所述产物I为模板，以所述待测寡核苷酸为引物，进行PCR扩增反应，若未得到PCR扩增产物，则确认所述寡核苷酸与所述目的基因组无相似性，若得到PCR扩增产物，则确认所述寡核苷酸与所述目的基因组有相似性；所述PCR扩增产物为非引物二聚体。实验表明，本发明专利技术所述的方法可以准确、直观地检测tag序列和某种生物基因组的相似性，并且操作简便，成本低，耗费时间少。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种检测寡核苷酸与目的基因组或转录组的相似性的方法。
技术介绍
与已知生物基因组或转录组序列无相似性(同源性)的寡核苷酸标签(oligonucleotide tag)在现代分子生物学应用中扮演越来越重要的作用。例如,在RNA模板特异性PCR扩增(RS-PCR)中，就是在反转录中使用了一种5’端带有一段寡核苷酸标签的反转录引物，在完成反转录反应后，以这段寡核苷酸标签为引物进行PCR扩增，就可以只扩增RNA的反转录产物，而不会扩增污染的基因组DNA，实现RNA模板的特异性PCR扩增，避免了假阳性的出现。其中，所使用的寡核苷酸标签必须与该生物基因组或转录组没有序列 相似性。在单核苷酸多态性分型(SNP genotyping)研究中，也经常使用一种“tag-antitag”系统。即，在核酸扩增中将每种可能的SNP类型和一种特定的寡核苷酸标签相连接，这种带有寡核苷酸标签的SNP序列将会和DNA微阵列或微球上的tag互补序列(antitag)相结合,从而判别出是否存在某种类型的SNP。与生物基因组或转录组无相似性的寡核苷酸标签还被广泛应用于基因芯片中的探针臂和多种高通量检测技术的接头、多种多重检测技术的“条码”(barCOde)等等，这些现代高通量检测技术的检测效果高度依赖于所用寡核苷酸标签的质量，其中衡量寡核苷酸标签质量的最重要的指标就是该标签与生物基因组或转录组的相似性是否足够低，如果相似性不够低，就会出现交叉杂交、非特异性扩增等问题，严重干扰这些检测技术的准确性。目前，人们主要依赖于生物信息学计算来得到与生物基因组无相似性的寡核苷酸标签序列。虽然可以通过这种基于计算机的计算得到大量的与生物基因组或转录组无相似性的寡核苷酸标签序列，但是由于算法的局限性，这种通过计算所推测出的相似性数据非常不可靠，常常与实际实验的结果相违背。目前检验tag和某种生物基因组或转录组相似性的常用实验方法是将该生物的全基因组序列制备成探针，固定于生物芯片上后与待检验的寡核苷酸标签进行杂交，观察杂交信号以判断标签序列与该物种基因组或转录组的相似性。这种方法成本十分高昂，操作繁琐，无法得到真正的应用。因此，目前迫切需要一种简单有效的实验方法，来验证利于计算机计算所得到的寡核苷酸标签序列与生物基因组或转录组的真实相似性情况。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种辅助检测寡核苷酸与目的基因组或目的转录组的相似性的方法。本专利技术所提供的辅助检测寡核苷酸与目的基因组或目的转录组的相似性的方法，包括如下步骤I)以目的基因组DNA或目的转录组RNA为模板，用5'末端连接有寡核苷酸A的随机引物作为引物，进行DNA合成反应，得到5’末端带有所述寡核苷酸A的DNA，记作产物I ;2)以所述产物I为模板，以寡核苷酸A为引物，进行PCR扩增反应，记录出现PCR扩增产物时的反应循环数，记作循环数A ;所述PCR扩增产物为非引物二聚体；3)用步骤I)和步骤2)相同的方法获得寡核苷酸B对应的循环数，记作循环数B ； 4)比较循环数A和循环数B的大小，若循环数A大于循环数B，则确认寡核苷酸A与所述目的基因组或所述目的转录组的相似性低于寡核苷酸B与所述目的基因组或所述目的转录组的相似性；若循环数A小于循环数B，则确认寡核苷酸A与所述目的基因组或所述目的转录组的相似性高于寡核苷酸B与所述目的基因组或所述目的转录组的相似性。上述方法中，步骤I)中所述5’末端带有所述寡核苷酸A的DNA，实际上是其中一条链的5’末端带有所述寡核苷酸A的双链DNA。 本专利技术的另一个目的是提供一种辅助检测寡核苷酸与目的基因组或目的转录组是否具有相似性的方法。本专利技术所提供的辅助检测寡核苷酸与目的基因组或目的转录组是否具有相似性的方法，包括如下步骤I)以目的基因组DNA或目的转录组RNA为模板，用5'末端连接有待测寡核苷酸的随机引物作为引物，进行DNA合成反应，得到5’末端带有所述寡核苷酸的DNA，记作产物I ;2)以所述产物I为模板，以所述寡核苷酸为引物，进行PCR扩增反应，出现PCR扩增产物时的循环数越大，则确认所述寡核苷酸与所述目的基因组或所述目的转录组相似性越低；具体地，若出现PCR扩增产物时的循环数小于25，则确认所述寡核苷酸与所述目的基因组或所述目的转录组相似性较高，若出现PCR扩增产物时的反应循环数大于35，则确认所述寡核苷酸与所述目的基因组或所述目的转录组没有相似性；所述PCR扩增产物为非引物二聚体。上述方法中，步骤I)中所述5’末端带有所述寡核苷酸的DNA，实际上是其中一条链的5’末端带有所述寡核苷酸的双链DNA。上述任一方法中，所述步骤I)中，DNA合成反应的方法包括如下步骤将所述目的基因组DNA、所述5，末端连接有寡核苷酸A的随机引物和水混合，进行变性，再进行DNA聚合酶链反应；或,所述步骤I)中，DNA合成反应的方法包括如下步骤将所述目的转录组RNA、所述5'末端连接有寡核苷酸A的随机引物和水混合，进行变性，再进行逆转录聚合酶链反应。上述任一方法中，所述步骤I)中，所述变性的方法为在95°C保持3分钟后冰浴3分钟。上述任一方法中,所述步骤I)中，所述DNA聚合酶链反应的方法包括如下步骤向变性后的产物中加入DNA聚合酶和DNA聚合酶反应液，先在37°C保持90分钟，再在70°C保持10分钟；或，所述步骤I)中，所述逆转录聚合酶链反应的方法包括如下步骤向变性后的产物中加入逆转录聚合酶和逆转录聚合酶反应液，先在37°C保持90分钟，再在70°C保持10分钟。上述任一方法中，所述步骤I)中，所述目的基因组DNA、所述5'末端连接有寡核苷酸A的随机引物、所述DNA聚合酶、所述DNA聚合酶反应液的配比为lug : 104mmoI : 5U : 5ul ；所述步骤I)中，所述目的转录组RNA、所述5'末端连接有寡核苷酸A的随机引物、所述逆转录聚合酶、所述逆转录聚合酶反应液的配比为lug l(r4mmol 5U 4ul.上述任一方法中，所述DNA聚合酶为klenow酶；所述DNA聚合酶反应液为Klenow酶缓冲液；所述逆转录聚合酶为M-Mlv酶；所述逆转录聚合酶反应液为M-Mlv酶缓冲液。 上述任一方法中，所述步骤2)中，所述PCR扩增反应为实时荧光定量PCR。上述任一方法中，所述步骤2)中，所述记录在所述反应的延伸过程中进行。上述任一方法中，所述目的基因组DNA为植物基因组DNA或动物基因组DNA或人的基因组DNA ;所述目的转录组RNA为植物转录组RNA或动物转录组RNA或人转录组RNA。上述任一方法中，所述随机引物的序列为NNNNNNNNN。上述任一所述方法中，所述寡核苷酸A、所述寡核苷酸B和所述寡核苷酸均具体为序列表中序列1、2、3或4所示。本专利技术方法的原理如图I所示。具体为以生物基因组DNA和总RNA为模板，以5’端带有寡核苷酸标签序列的随机引物(tag_9N)为引物，在klenow酶和反转录酶作用下进行反应。得到5’端带有tag序列的DNA。以上述5’端带tag序列的DNA为模板，以该tag为引物，进行PCR扩增反应。如果没有扩增产物，则表明该tag和基因组或转录组序列没有相似性。越早出现扩增产物，则说明该tag序列与该基因组或转录组序列的相似性越高本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种辅助检测寡核苷酸与目的基因组或目的转录组的相似性的方法，包括如下步骤：1)以目的基因组DNA或目的转录组RNA为模板，用5′末端连接有寡核苷酸A的随机引物作为引物，进行DNA合成反应，得到5’末端带有所述寡核苷酸A的DNA，记作产物I；2)以所述产物I为模板，以寡核苷酸A为引物，进行PCR扩增反应，记录出现PCR扩增产物时的反应循环数，记作循环数A；所述PCR扩增产物为非引物二聚体；3)用步骤1)和步骤2)相同的方法获得寡核苷酸B对应的循环数，记作循环数B；4)比较循环数A和循环数B的大小，若循环数A大于循环数B，则确认寡核苷酸A与所述目的基因组或所述目的转录组的相似性低于寡核苷酸B与所述目的基因组或所述目的转录组的相似性；若循环数A小于循环数B，则确认寡核苷酸A与所述目的基因组或所述目的转录组的相似性高于寡核苷酸B与所述目的基因组或所述目的转录组的相似性。

【技术特征摘要】
2011.04.08 CN 201110087519.41.一种辅助检测寡核苷酸与目的基因组或目的转录组的相似性的方法，包括如下步骤1)以目的基因组DNA或目的转录组RNA为模板，用5'末端连接有寡核苷酸A的随机引物作为引物，进行DNA合成反应，得到5’末端带有所述寡核苷酸A的DNA，记作产物I ; 2)以所述产物I为模板，以寡核苷酸A为引物，进行PCR扩增反应，记录出现PCR扩增产物时的反应循环数，记作循环数A ;所述PCR扩增产物为非引物二聚体； 3)用步骤I)和步骤2)相同的方法获得寡核苷酸B对应的循环数，记作循环数B; 4)比较循环数A和循环数B的大小，若循环数A大于循环数B，则确认寡核苷酸A与所述目的基因组或所述目的转录组的相似性低于寡核苷酸B与所述目的基因组或所述目的转录组的相似性；若循环数A小于循环数B，则确认寡核苷酸A与所述目的基因组或所述目的转录组的相似性高于寡核苷酸B与所述目的基因组或所述目的转录组的相似性。2.一种辅助检测寡核苷酸与目的基因组或目的转录组是否具有相似性的方法，包括如下步骤1)以目的基因组DNA或目的转录组RNA为模板，用5'末端连接有待测寡核苷酸的随机引物作为引物，进行DNA合成反应，得到5’末端带有所述寡核苷酸的DNA，记作产物I ; 2)以所述产物I为模板，以所述寡核苷酸为引物，进行PCR扩增反应，出现PCR扩增产物时的循环数越大，则确认所述寡核苷酸与所述目的基因组或所述目的转录组相似性越低； 具体地，若出现PCR扩增产物时的循环数小于25，则确认所述寡核苷酸与所述目的基因组或所述目的转录组相似性较高，若出现PCR扩增产物时的反应循环数大于35，则确认所述寡核苷酸与所述目的基因组或所述目的转录组没有相似性；所述PCR扩增产物为非引物二聚体。3.根据权利要求I或2所述的方法，其特征在于所述步骤I)中，DNA合成反应的方法包括如下步骤将所述目的基因组DNA、所述5'末端连接有寡核苷酸A的随机引物和水混合，进行变性，再进行DNA聚合酶链反应；或，所...

【专利技术属性】
技术研发人员：张岩，孙义民，杨萍，张亮，
申请(专利权)人：博奥生物有限公司，清华大学，
类型：发明
国别省市：