具有1,3-丁二醇生产功能的基因重组微生物及其应用制造技术

本发明专利技术的目的是提供有效生产光学活性的1,3-丁二醇的基因重组微生物，所述1,3-丁二醇作为医药的合成原料等有利用价值，以及提供使用基因重组微生物有效生产光学活性的1,3-丁二醇的方法。本发明专利技术人等为了解决上述问题，进行了深入的研究，结果成功的生产了这样的基因重组微生物，其催化由式1代表的还原性反应的酶活性得到增强，并生产由式2代表的二醇化合物。(式中R代表C1-3烷基或氢)(式中R代表C1-3烷基或氢)

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及赋予了 1，3-丁ニ醇生产功能的基因重组微生物，和使用所述微生物生产1，3-丁ニ醇的方法。背景领域I, 3- 丁ニ醇可用作具有多种用途的化学品，例如保湿剂、树脂原料、表面活性剤、吸湿剂和溶剂等，以及作为它们的原材料而具有利用价值。它的光学活性分子(R)_l，3-丁ニ醇和(S)-1，3-丁ニ醇也可用作医药、农药等的合成原料而具有利用价值。常规上，I, 3- 丁ニ醇是通过以化石资源石油为基础通过化学方法制造的こ醛作为原料，形成丁间醇醛后，进行氢化的化学方法制造的。另ー方面，可以通过专利文件I展示 的方法生产光学活性的1，3- 丁ニ醇，在专利文件I展示的方法中通过使能够优先同化其-或(R)-异构体的微生物(例如，近平滑假丝酵母(Candidapalapsilosis)或乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces Iactis)等)作用于从化石资源化学合成的外消旋1，3_丁ニ醇，然后收集剩余的对映体，来生产(R)-或(S)-I, 3-丁ニ醇。此外，在专利文件2展示的方法中，通过使微生物(例如，乳酸克鲁维酵母或近平滑假丝酵母等)作用于从化石资源化学合成的4-羟基-2- 丁酮，利用微生物的不对称还原活性，生产(R) _或(S)-1，3-丁ニ醇。此外，还有在一个或两个步骤中使用立体选择性的氧化还原酶或大量表达此类酶的基因重组菌生产光学活性的1，3-丁ニ醇的方法。此类方法包括使用地霉属(Geotricumsp.)来源的(S)-特异性的仲醇脱氢酶，由外消旋体生产(R)-l，3-丁ニ醇(非专利文件I);使用表达近平滑假丝酵母来源的(S)-特异性的仲醇脱氢酶的基因重组大肠杆菌(Escherichia coli),由外消旋体生产(R)_l，3_ 丁ニ醇(专利文件3);使用表达乳酸克鲁维酵母来源的(R)-特异性的2，3-丁ニ醇脱氢酶的基因重组大肠杆菌，由4-羟基-2-丁酮生产(R)-1，3-丁ニ醇，或由外消旋体生产(S)-1，3-丁ニ醇(专利文件4)。然而，所有这些方法都使用需要非天然化合物作为底物，必须化学合成底物。同时，在非专利文件2中，在含有木薯废弃物的培养基中培养Geotricumfragrans的培养液中检测到1，3- 丁ニ醇。然而，I, 3- 丁ニ醇是作为ー种挥发性的物质而被发现，其目的不在于生产1，3-丁ニ醇。在近年，出于化石资源耗尽和全球变暖的观点，对于建立使用生物量(biomass)(植物资源)来源的原料作为可再生资源的化学品生产体系具有日益增长的社会需求。例如，已知可以从ー种生物量(biomass)来源的材料——葡萄糖，利用丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)所示的丙酮-丁醇发酵通路,通过CoA衍生物生产溶剂。对于该物种的典型菌株，丙酮丁醇梭菌ATCC824，已测序了其完整的基因组DNA序列，并已经掲示了丙酮-丁醇发酵细菌的特征性溶剂生产基因adhE (具有ECl. 2. I. 10和ECl. I. I. I两功能的醛-醇脱氢酶)(非专利文件3)。只有极少数关于丙酮丁醇梭菌来源的adhE的基因产物(具有ECl. 2. I. 10和ECl. I. I. I两功能的醛-醇脱氢酶)的酶学报告，并且在非专利文件4中，仅对使用丙酮丁醇梭菌DSM1732的无细胞提取液，以丁醇或丁醛作为底物，实施了对丁醇脱氢酶活性的评估，和使用丁醛或丁酰-CoA作为底物，实施了对丁醛脱氢酶活性的评估。adhE基因产物从未被用于除非专利文件5所示的生产I- 丁醇以外的其他目的。没有关于从生物量来源的原料生产1，3-丁ニ醇的报道，需要从可再生的资源(如生物量等)生产1，3- 丁ニ醇的方法。现有技术文件专利文件专利文件I :日本专利申请公开出版号(JP-A)H02_195897(未审查，已出版的日 本专利申请)专利文件2 JP-A (公开)H02-31684专利文件3 JP-A (公开)2000-197485专利文件4 JP-A (公开)2002-345479非专利文件非专利文件I :Biosci. Biotech. Biochem.，1996，60(7)，1191-1192非专利文件2 Proc. Biochem.，2003，39，411-414非专利文件3 J. Bacteriol.，2001，183 (16)，4823-4838非专利文件4 Appl. Microbiol. Biotechnol.，1987，26，268-272非专利文件5 Metabol. Engineer.，2008，10，305-311专利技术概述专利技术要解决的问题本专利技术的目标是提供能够以生物量(植物资源)的可再生资源作为原料生产1，3-丁ニ醇的微生物。本专利技术的另ー个目标是提供可以使用具有目的功能的微生物生产1，3-丁ニ醇的方法。解决问题的方法作为深入研究开发从可再生的资源即生物量作为原料生产1，3- 丁ニ醇的方法的結果，本专利技术人发现丙酮丁醇梭菌来源的AdhE (CaAdhE)不仅通过NADH依赖性的方式还原こ酰-Cok和丁酰-CoA产生こ醛和丁醛，而且令人惊讶的通过还原在3位具有羟基的3-羟丁酰-CoA，产生3-羟基丁醛。本专利技术人还发现，CaAdhE具有以NADH依赖性的方式还原3-羟基丁醛的活性，从而催化产生1，3- 丁ニ醇的反应。通过以葡萄糖作为碳源，培养能够共表达CaAdhE、β -酮硫解酶(β -ketothiolase)(催化从2分子的こ酰-CoA生成こ酰こ酰-Cok的反应)和3-羟丁酰-Cok脱氢酶(催化以NAD(P)H-依赖性的方式，还原こ酰こ酰-CoA的3-羰基生成3-羟丁酰-CoA的反应)的基因重组大肠杆菌，成功的实现了有效生产1，3-丁ニ醇。基于上述发现，本专利技术人利用微生物所具有的代谢产物即こ酰-CoA，通过使在含上述酶的微生物中发生下述式8表示的反应，成功的生产了 1，3- 丁ニ醇，从而完成了本专利技术。即本专利技术提供生产1，3- 丁ニ醇的微生物。本专利技术还提供使用此类微生物有效生产1，3_ 丁ニ醇的方法。[式8]本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2009.10.30 JP 2009-2512761.下述(I)的酶活性得到增强的基因重组微生物，所述基因重组微生物由发酵底物生产式2代表的1，3_烷基ニ醇， (I)按照式I所示，使用NADH和/或NADPH作为辅酶，通过还原3-羟基酰基-Coh,来催化生产3-羟基烷基醛的酶活性2.权利要求I的基因重组微生物,其中在权利要求I中所述的式I和2中的R均是甲基，由发酵底物生产1，3- 丁ニ醇。3.权利要求I或2的基因重组微生物，其中权利要求2所述的由发酵底物生产的1，3-丁ニ醇是(R)-1,3-丁ニ醇。4.权利要求I至3中任ー项的基因重组微生物，其中催化权利要求I的(I)所述的式I代表的反应的酶在国际酶学分类中分类为EC I. 2. I. 10。5.权利要求I至4中任ー项的基因重组微生物，其中催化权利要求I的(I)所述的式I代表的反应的酶是下述(a广下述(e)中任ー项所述的酶 (a)具有SEQID NO: 1、65或67的氨基酸序列的蛋白质； (b)具有在SEQID NO: 1、65或67的氨基酸序列中取代、缺失、插入或添加了一个或多个氨基酸的氨基酸序列的酶； (c)具有由SEQID NO:2、66或68的核苷酸序列编码的氨基酸序列的酶； (d)具有由在严格的条件下与包括SEQID NO: 2、66或68的核苷酸序列的DNA杂交的DNA编码的氨基酸序列的酶；和 (e)与SEQID NO: 1、65或67的氨基酸序列具有85%或更高的同一性的蛋白质。6.权利要求I至5中任ー项的基因重组微生物，其是除权利要求I所述的下述(I)的酶活性之外，下述(2)的酶活性也得到增强的基因重组微生物，所述基因重组微生物由发酵底物生产式2代表的1，3-烷基ニ醇， (1)按照式I所示，使用NADH和/或NADPH作为辅酶，通过还原3-羟基酰基-Coh,来催化生产3-羟基烷基醛的酶活性；和 (2)按照式3所示，使用NADH和/或NADPH作为辅酶，通过还原3-羟基烷基醛，来催化生产式2代表的1，3-烷基ニ醇的酶活性， 式3没有显示两个反应，而仅显示了由醛生产醇 [式I]7.权利要求6的基因重组微生物，其中在权利要求6中所述的式I至3中的R均是甲基，由发酵底物生产1，3- 丁ニ醇。8.权利要求6或7的基因重组微生物，其中权利要求7所述的由发酵底物生产的1，3-丁ニ醇是(R)-1,3-丁ニ醇。9.权利要求6至8中任ー项的基因重组微生物，其中催化权利要求6中所述的式3代表的反应的酶是下述(a广下述(e)中任ー项所述的酶 (...

【专利技术属性】
技术研发人员：冈林智仁，中岛贤则，山本浩明，
申请(专利权)人：株式会社大赛璐，
类型：发明
国别省市：