本发明专利技术公开了一种牛iPS细胞诱导分化形成卵母细胞的方法。该方法包括猪卵泡液制作、牛iPS细胞培养、牛iPS细胞的卵母细胞定向分化三个步骤。本发明专利技术将牛iPS细胞在限定的诱导条件下分化成卵母细胞。由于牛iPS细胞的诱导仅需要种用牛少量的皮肤细胞，牛iPS细胞的应用能够有效避免分离牛ES细胞需要破坏大量优质胚胎的弊端。因此，该方法在牛的抗病育种、乳腺生物反应器生产、优秀遗传资源的保护和开发等方面都具有着广阔的应用前景和发展潜力。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及ー种。
技术介绍
iPS细胞(induced pluripotent stem cell)又称诱导多能性干细胞，同ES细胞(embryonic stem cell) ー样具有发育的全能性,在人类的再生医学和家畜的育种改良等方面都具有着重要的意义。iPS细胞在体外具有強大的再生能力和可塑性，在一定的诱导环境条件下能够分化形成雌性或雄性生殖细胞，因此，iPS细胞相关技术的深入研究和应用能够加快家畜的遗传育种速度和优秀品种的保护与开发。另外，转基因动物的生产是 当前生命科学研究的热点。动物转基因在生物制药、抗病育种和遗传性能改良等方面都具有着重要的应用前景和发展潜力，但目前转基因动物的生产存在目的基因表达率低、表达不稳定、动物生产效率低等诸多问题。根据iPS细胞強大的再生能力和可塑性，iPS细胞能够高效地进行外源基因导入、基因敲除和基因改造等遗传修饰操作，在定向诱导环境条件下分化形成遗传修饰的卵母细胞用于转基因，能够从根本上解决动物转基因效率低和基因表达不稳定等根本问题。因此，iPS细胞向卵母细胞的定向诱导分化将成为生命科学研究的热点，同时，也将成为现代畜牧业可持续发展的强大动力。牛作为重要的家畜品种之一，牛iPS细胞的诱导仅需要种用牛少量的皮肤细胞，由于存在高产优质牛的胚胎来源稀少、牛ES细胞分离培养成功率低等诸多问题，牛iPS细胞的应用能够有效避免分离牛ES细胞需要破坏大量优质胚胎的弊端。体外牛iPS细胞能够高效地进行外源基因导入、敲除和改造等遗传修饰操作，基因修饰后的牛iPS细胞在限定的诱导条件下分化成卵母细胞，这种牛转基因修饰生殖细胞将成为牛转基因育种的理想材料，并将会极大地推动牛转基因生产的快速高效发展。因此，牛iPS细胞向卵母细胞的定向分化在牛的抗病育种、乳腺生物反应器生产、优秀遗传资源的保护和开发等方面都具有着广阔的应用前景和发展潜力，目前有关牛iPS细胞向卵母细胞分化的研究尚未见相关报道。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供ー种。为了解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案是，ー种，包括以下步骤 (I)猪卵泡液制作 将采集的卵巣用75 %酒精喷洒消毒卵巣表面，然后用含青链霉素事先预热的37で生理盐水清洗，抽取来自屠宰场卵巢表面直径6 mm卵泡内卵泡液，抽取的卵泡液经离心去组织细胞残渣碎片后，小心吸取卵泡上清液冻存备用；(2)牛iPS细胞培养 牛iPS细胞的培养液主要组成为，含I OOO U/ml LIF (Chemicon)、4 ng/ml bFGF(Sigma)和15% FBS的高糖DMEM(Hyclone)培养液；牛iPS细胞培养使用含LIF和bFGF的高糖DMEM培养液，接种细胞于丝裂霉素处理的12. 5天小鼠胎儿成纤维细胞饲养层上，每天对细胞培养液采取半量换液方式进行换液，姆两天消化传代一次，使用I mg/ml dispase(Sigma)消化液进行消化传代，传代按照I :4进行扩散培养，传代后的牛iPS细胞重新接种到成纤维细胞饲养层上进行培养； (3)牛iPS细胞的卵母细胞定向分化 牛iPS细胞用胰酶溶液进行消化传代，传代后的牛iPS细胞接种到没有饲养层细胞的培养皿上，并且连续无饲养层培养和传代，以去除牛iPS细胞前期培养时所夹带的饲养层细胞，经过连续消化培养传代后，收集不含饲养层细胞的牛iPS细胞，收集细胞后，离心去上清，用不含LIF和bFGF的高糖DMEM培养液重悬，采用悬滴培养的方式制作牛iPS细胞拟胚体，把制作形成的牛iPS细胞拟胚体接种到低粘附カ的培养皿上进行悬浮培养，每两天对细胞培养液采取半量换液方式进行换液，经过悬浮培养后，牛iPS细胞拟胚体转接到明胶包被的培养皿上，添加含10% FBS、10%猪卵泡液和0.5 μ M视黄酸(RA)的DMEM/F12培养液进行诱导培养。本专利技术的有益效果 由于牛iPS细胞仅需要少量皮肤来源的细胞就可以形成，而且诱导形成的iPS细胞具有強大的再生能力和可塑性，本专利技术将牛少量皮肤来源的细胞经过体外操作分化形成大量的卵母细胞。该方法在牛的抗病育种、乳腺生物反应器生产、优秀遗传资源的保护和开发等方面具有着广阔的应用前景和发展潜力。附图说明下面结合附图和具体实施方式对本专利技术作进ー步详细的说明。图I是牛iPS细胞集落形态。图2是牛iPS细胞诱导分化形成的卵母细胞形态，箭头所指为不同状态下分化形成的牛卵母细胞。具体实施例方式(I)猪卵泡液制作 试验所用猪卵巣均来源于屠宰厂，猪卵巣由于是性腺组织，屠宰后的猪卵巢组织不能用于食品，但用于生殖发育的相关科学研究，意义重大。将采集的卵巣放入37で含青链霉素的生理盐水中半小时内送回实验室。用75 %酒精喷洒消毒卵巣表面，然后用含青链霉素事先预热的37で生理盐水清洗3次，用无菌注射器抽取卵巢表面直径6 mm卵泡内卵泡液，抽取的卵泡液经离心去组织细胞残渣碎片后，小心吸取卵泡上清液冻存备用。(2)牛iPS细胞培养 牛iPS细胞的培养液主要组成为，含1000 U/ml LIF (Chemicon)、4 ng/ml bFGF(Sigma)和15% FBS的高糖DMEM培养液。接种细胞于丝裂霉素处理的12. 5天小鼠胎儿成纤维细胞饲养层上，每天对培养液采取半量换液方式进行换液，每两天传代一次，使用消化液为I mg/ml dispase (Sigma)进行消化传代,传代按照I :4进行扩散培养,传代后的牛iPS细胞重新接种到成纤维细胞饲养层上进行培养。(3)牛iPS细胞的卵母细胞定向分化 牛iPS细胞用胰酶溶液进行消化传代，传代后的牛iPS细胞接种到没有饲养层细胞的培养皿上，连续传代培养以去除牛iPS细胞培养时所带的饲养层细胞，经过连续消化培养传代后，收集不含饲养层细胞的牛iPS细胞，收集细胞后，离心去上清，用不含LIF和bFGF的高糖DMEM培养液重悬，采用悬滴培养的方式制作牛iPS细胞拟胚体，把制作形成的牛iPS细胞拟胚体接种到低粘附カ的培养皿上进行悬浮培养，每两天对培养液采取半量换液方式进行换液，经过4天悬浮培养后，牛iPS细胞拟胚体转接到明胶包被的培养皿上，添加含10% FBS、10%猪卵泡液和0.5 μ M视黄酸(RA)的DMEM/F12培养液进行另外4天的诱导培养。(4)牛卵母细胞的免疫荧光检测 细胞经4%多聚甲醛固定，1%牛血清白蛋白(BSA)室温封闭30分钟，添加ー抗为兔抗Nobox (Abcam)和 Vasa (Abeam) 0ct4 按 I 200 稀释后 4°C鮮育过夜。PBS 洗 3 次，CY3红色荧光标记的ニ抗按I :200稀释后室温避光孵育I小吋，PBS洗3次，用lyg/ml的DAPI (Roche)进行细胞核染色I分钟后荧光显微镜下观察結果。(5)结果 经过离心去沉淀操作之后，制作的猪卵泡液清澈透亮、液体颜色均一为淡黄色，液体中无任何悬浮物或细小颗粒，卵泡液分装一 20°C保存备用。诱导使用的牛iPS细胞集落为鸟巢状形态、集落中细胞紧密结合突出于饲养层细胞表面，而饲养层成纤维细胞则呈现明显的纤维状，细胞集落同饲养层细胞形成清晰的边界(图I)。在1:4进行传代培养的条件下，每隔2 3天传代一次。牛iPS细胞集落AP表达为阳性，核型正常。细胞集本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.I、牛iPS细胞诱导分化形成卵母细胞的方法,包括以下步骤 (1)猪卵泡液制作 将采集的卵巢用75 %酒精喷洒消毒卵巢表面，然后用含青链霉素事先预热的37°C生理盐水清洗，抽取来自屠宰场卵巢表面直径6 mm卵泡内卵泡液，抽取的卵泡液经离心去组织细胞残渣碎片后，小心吸取卵泡上清液冻存备用； (2)牛iPS细胞培养 牛iPS细胞的培养液主要组成为，含I OOO U/ml LIF、4 ng/ml bFGF和15% FBS的高糖DMEM培养液；牛iPS细胞培养使用含LIF和bFGF的高糖DMEM培养液，接种细胞于丝裂霉素处理的12. 5天小鼠胎儿成纤维细胞饲养层上，每天对细胞培养液采取半量换液方式进行换液，每两天消化传代一次，使用I mg/ml dispase消化液进行消化传代,传代按照I :4进行扩...
【专利技术属性】
技术研发人员：曹鸿国，章孝荣，张运海，陶勇，刘亚，李运生，
申请(专利权)人：安徽农业大学，
类型：发明
国别省市：
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