本发明专利技术涉及一种产西索米星的突变株，应用于抗生素制造，属于抗生素制药领域。所述突变株为依纽小单孢菌（Micromonosporainyoensis）HP388，已于2012年3月19日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，保藏编号为CGMCCNo.5921。本发明专利技术的突变菌株HP388的最显著特征是发酵单位高，生产工艺稳定，便于控制，耗氧量小，成本低，污染小，产品质量好。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于抗生素制药领域，涉及一株产西索米星突变菌株，应用于抗生素制造。
技术介绍
西索米星主要用于治疗由敏感的革兰阴性杆菌所致的严重感染，如铜绿假单胞菌、变形杆菌属(D引哚阳性和阴性)、大肠埃希菌、克雷伯菌属、肠杆菌属、沙雷菌属及枸橼酸杆菌属等所致的新生儿脓毒症、败血症、中枢神经系统感染(包括脑膜炎)、尿路生殖系统感染、呼吸道感染、胃肠道感染、腹膜炎、胆道感染、皮肤或骨骼感染、中耳炎、鼻窦炎、软组织感染、李斯特菌病等。小单孢菌可产生丰富的次级代谢产物，特别是氨基糖苷类抗生素，如庆大霉素、西索米星和福提米星等。这些小单孢菌分布奇特，生长缓慢且细胞壁结构特殊，故研究进展缓慢。因此，要得到高产稳产的西索米星产生菌，极其困难。由于缺乏通用的基因操作系统， 小单孢菌遗传操作困难，使得对其分子生物学的研究也大大落后于链霉菌依纽小单孢菌是西索米星产生菌。西索米星属氨基糖苷类抗生素，已在临床上应用了近半个世纪，是中国、乃至全世界抗感染必备的基本药物。西索米星产生菌属多组分代谢产物，但西索米星是其主要组分，其结构特点是分子中含有一个双键。西索米星 (Sisomicin)是进一步合成抗耐药菌药物奈替米星(Netilmicin)的母体；最新研究发现， 氨基糖苷类抗生素还具有抗HIV等功效。因此对该类稀有药用微生物进行深入研究，特别是分子遗传学方面的研究，生物合成基因的研究，次级代谢产物生产水平提高的研究等，都极具意义。尽管人们对小单孢菌和西索米星的研究已近五十年，也取得了一些可喜的成果， 但一直未有重大的突破。青霉素在五十余年的研究开发过程中，效价提高了近万倍，而西索米星四十年中仅提高了几十倍，差别非常悬殊。二十世纪八十年代兴起的链霉菌细胞工程， 链霉菌基因工程，已在抗生素生物合成基因的克隆、产量提高、组分改善及杂合抗生素研究等方面取得了一定的进展，但在小单孢菌中的应用进展缓慢。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一株高产西索米星的突变株。本专利技术所述突变株为依纽小单抱菌(#icr0 0/ 05770ra inyoensis) HP 388,已于 2012年3月19日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，保藏编号为 CGMCC No. 5921。本专利技术还提供了所述的产西索米星的突变株的发酵方法，依纽小单孢菌 (#icromonospora inyoensis) HP388发酵前先用稀释平板法分离出单菌落后，再转接于斜面培养基，35-40°C培养2-5天；再以4-6%的接种量接种于种子培养基，35_40°C摇床培养18-48 h，转速为260-300rpm，然后按8-12%接种量转接于发酵培养基，35_40°C摇床培养4-5天，转速为260-300rpm ;所述斜面培养基以重量百分数计，可溶性淀粉1.0-2. 0%，麸皮 I. 0-2. 0%, MgSO4 6H20 0. 01-0. 05%, KNO3 0. 1-0. 5%, K2HPO4 3H20 0. 01-0. 05%, NaCl0.01-0. 09%, CaCO3 0. 1-0. 50%,琼脂I. 8-2. 2%,余量为水，pH7_8 ;种子培养基以重量百分数计，葡萄糖0. 1-1. 0%，淀粉I. 0-2. 0%，玉米粉0. 5-2. 5%，蛋白胨0. 1-0. 8%，黄豆饼粉0.5-1. 5%, KNO3 0. 05-0. 10%, CaCO3 0. 1-0. 5%,余量为水，pH6. 5-7. 5，发酵培养基以重量百分数计，淀粉3. 0-6. 0%，玉米粉I. 0-2. 0%，蛋白胨0. 1-0. 8%，黄豆饼粉I. 0-4. 0 %， KNO3 0. 01-0. 10%, (NH4)2SO4 0. 1-0. 5%, CaCO3 0. 1-0. 5%，淀粉酶 0. 001-0. 025%，余量为水， pH6. 5-7. 5。本专利技术还提供了所述的突变菌株HP388在制备抗菌药物中的应用。本专利技术通过以下反复持续筛选与驯化，最终得到了依纽小单孢菌HP388 :菌株 HP388的驯化筛选，需要多个循环，每个循环主要包括以下过程出发菌株T125 (依纽小单孢菌澄江变种T125)—分离纯化一菌丝培养一原生质体制备 —原生质体融合一耐自身代谢产物(西索米星)梯度筛选一突变株生产力测定一正突变菌株，通过反复筛选得到菌株HP388，通过培养基及培养条件优化一小试一中试一工业化放大，得到西索米星产品。依纽小单孢菌HP388 (CGMCC No. 5921)的培养特征本菌株斜面外观呈深紫红色。 加入梯度自身代谢产物西索米星，浓度控制在5(Tl000 u/mL左右，可抑制其色素的产生，经驯化后，最终可变成不产色素的菌株，在斜面呈淡黄色。本专利技术采用工业微生物育种方法，对依纽小单孢菌T125进行选育和筛选，得到西索米星发酵稳定高产的突变株。该菌株已于2012年3月19日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保蒇，其简称CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号， 保藏编号为CGMCC No. 5921。突变菌株HP388的最显著特征是发酵单位高，生产工艺稳定，便于控制，耗氧量小，成本低，污染小，产品质量好。附图说明图I依纽小单孢菌HP388西索米星生物合成基因簇。图2为依纽小单孢菌388染色体DNA与质粒DNA酶切效果电泳检测图；其中M 入-AcoT14 marker ； I HPl 102 染色体；2 :酶切后的 HP1102 染色体 /Sau^A I ；3 :双酶切 Supercos-l/AXe I /BamW I ；4 :单酶切 Supercos-l/AXe I。图3为西索米星生物合成基因簇目标克隆子PCR筛选确定图；其中M:DL5000 marker ；1 :经M1/M2引物扩增确定的克隆子；2 :经S1/S2引物扩增确定的克隆子；3 :经Cl/ C2引物扩增确定的克隆子。图4为120301批西索米星的HPLC分析结果。图5为120302批西索米星的HPLC分析结果。图6为120303批西索米星的HPLC分析结果。 具体实施例方式实施例I :本专利技术的菌株HP388的驯化筛选，至少需要10个循环以上，每个循环主要包括以下过程 取出发菌株T125 (依纽小单孢菌澄江变种T125)培养好的斜面，加入3ml无菌水，用接种针轻轻地将孢子刮下，取出孢子悬液，于振荡器上充分震荡，使分散成单孢子，然后进行梯度稀释(10°、10' 10' 10' 10' 10' 10' 10〃)，涂布平板，紫外线照射(10、20、30、40、50 秒)后，于37°C培养，分离单菌落。当单菌落生长到可以辨别其特征后(25天)，挑取不同形态特征的菌落，进行深层发酵培养(6天)，发酵毕，检测发酵单位，保存高单位者，供下一步使用。取以上优质菌株，培养菌丝，制备原生质体，采用单亲灭活自身原生质体融合法 (自身原生质体融合，将一份灭火后制备原生质体，一份不灭火活制备原生质体，然后两份混合，即所谓单亲灭火自身原生质体融合)进行原生质体融合，涂布平板，于37°C培养到长好菌落后(25天)，刮下孢子，如上制备单孢子悬液，梯度稀释，涂布平板，以不同梯度的西索米星溶液覆盖，使终浓度本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：洪文荣，张国华，宋逸婷，沈斌彬，黄俊龙，
申请(专利权)人：福州大学，浙江震元制药有限公司，
类型：发明
国别省市：
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