CD137L在制备治疗非小细胞肺癌药物中的应用；本发明专利技术首次提出CD137L可以治疗肺癌，特别是非小细胞性肺癌，为开发相关药物，作为药物筛选靶点，提供可能和应用，具有巨大应用前景和市场价值。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及CD137L在制备治疗非小细胞肺癌药物中的应用。
技术介绍
共刺激分子(costimulatory molecule)在免疫应答中起了极其重要的调节作用。共刺激信号是1970年Brestcher和Cohn在T细胞激活双信号学说的基础上首先提出并证实的，未致敏T细胞通过“抗原肽-MHC-TCR”三元体得到抗原信号(第一信号)后，需要有共刺激分子提供激活信号(第二信号)方能活化，第二信号称为共刺激信号。根据结构可将共刺激分子分为两类(I)肿瘤坏死因子(TNF)-肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族，包括⑶27 配体(Ligand) (CD27L) - CD27、CD30L - CD30、CD40L-CD40、0X40L-0X40、CD137L-CD137、 FasL-Fas 等；(2)免疫球蛋白超家族，如 B7-1/B7-2-CD28、PDL1/PDL2-PD-1 等。⑶137L(⑶137配体)是重要的共刺激分子，为II型跨膜糖蛋白。编码人⑶137L 的基因位于19pl3. 3，其编码产物为254个氨基酸，其中胞浆区28个氨基酸，跨膜区21 个氛基酸，胞外区205个氛基酸。其氛基酸序列为meyasdasld peapwppapr aracrvlpwa lvagllllll laaacavfla cpwavsgara spgsaasprl regpelspdd paglldlrqg mfaqlvaqnv llidgplswy sdpglagvsl tgglsykedt kelvvakagv yyvffqlelr rvvagegsgs vslalhlqpl rsaagaaalaltvdlppass earnsafgfq grllhlsagq rlgvhlhtea rarhawqltq gatvlglfrv tpeipaglps prse, CD137L表达于各种抗原递呈细胞(APC)如活化的B细胞、单核细胞、树突状细胞(DC)等表面。⑶137L的受体⑶137(4-1BB)主要表达于活化的T细胞，单核细胞等细胞表面。⑶137L作用于⑶137后可以通过TRAF2、TRAF1和MAPK等途径传递细胞内信号，促进T细胞的活化，增殖，细胞因子分泌的增加，及活化诱导的细胞凋亡(AICD)的抑制。⑶137L与⑶137结合后产生的共刺激信号能协同⑶28信号，也可不依赖于⑶28-B7而发挥对T细胞的共刺激作用。CD137也表达在NK细胞的表面并且参与了 NK细胞的功能调节，激发NK细胞上的⑶137分子，能促进NK细胞增殖和IFN- Y的分泌，并且这种激活的 NK细胞通过和CTL的相互作用增强CTL的杀伤活性。Salih报道了在某些T和B系白血病肿瘤细胞株的细胞膜上，有⑶137L和⑶137分子的组成性共表达，虽然两者都呈低表达，但 ⑶137L和⑶137信号均可促进白血病细胞株的增殖。但未见⑶137L在治疗非小细胞肺癌作用的报道。
技术实现思路
本专利技术的技术方案为CD137L在制备治疗非小细胞肺癌药物中的应用。有益效果本专利技术首次提出CD137L可以治疗肺癌，特别是非小细胞性肺癌，为开发相关药物，作为药物筛选靶点，提供可能和应用，具有巨大应用前景和市场价值。本专利技术在临床方面进一步专利技术⑶137L的表达量与非小细胞性肺癌(NSCLC)临床参数之间的关系，为非小细胞性肺癌(NSCLC)的预后判断及治疗提供新的理论依据。具体实施例方式以下结合实施例对本专利技术作进一步详细描述。实施例II、⑶137L基因的克隆与鉴定取对数生长期的人肺腺癌细胞A549细胞提取总RNA，mRNA逆转录为cDNA。克隆 hCD137L(Genbank登录号GI: 209954675)片段的引物上下游分别加酶切位点Not I和Xho I，片段长度为 794 bp ο 引物序列如下Forward 5 一 ATT CGC GGCCGC A TGG AAT ACG CCT CTG ACG CTT C 一 3，Reverse 5 一 GGC CCT CGA GCG CCG CC TTA TTC CGA CCT CGG TGA AGG GA —3,进行PCR反应；PCR操作过程94°C预变性3 min，94°C变性30 S，68°C退火/ 延伸2 min，30循环，最后70°C延伸3 min。切胶回收相应大小的产物片段，并用试剂盒进行纯化。2、连接、转化与鉴定用限制性核酸内切酶(限制性内切酶HindIII和Xba I)分别消化纯化后的克隆产物和质粒pcDNA3(购自Takara公司)，回收目的片段，用T4连接酶连接后转化感受态E. coli DI-I5a(购自Takara公司)，抽提质粒。重组质粒经双酶切及基因测序鉴定，命名为pcDNA3 一 hCD137L。取 pBTdel — 279 (购自 Omega Bio-Tek 公司)和 pcDNA3 — hCD137L 分别用 Hind n^PXba I双酶切，获得两端为HindIII和Xba I位点的⑶137L片断，并将其连接到有同样酶切位点的PBTdel — 279质粒上，获得的重组质粒命名为pBTdel. 279 一 hCD137L，双酶切鉴定。3、基因转染肺癌细胞株A549及正常人胚肺成纤维细胞株HELF细胞株取对数生长期的A549细胞，取合适的密度进行铺板，分别取重组质粒pcDNA3 — h⑶137L和pBTdel — 279 一 h⑶137L，按转染试剂盒说明书进行转染，继续培养。3、转染后细胞⑶137L的检测用RT-PCR及流式细胞术的方法，检测转染后 CD137L的表达。实施例2应用免疫组化链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶法(Streptavidin-perosidase, SP) 检测⑶137L在非小细胞肺癌(NSCLC)中的表达61例非小细胞肺癌组织标本(南京医科大学第一附属医院2006-01—2008-12经手术肺癌标本61例，由南京医科大学第一附属医院病理科鉴定)均经10%的甲醛固定，石蜡包埋，4 μ m厚连续切片。兔抗人⑶137L单克隆抗体购自Epitomics公司，单抗工作液浓度为 lug/ml, SP免疫组织化学试剂盒购自福州迈新生物技术开发公司，DBA显色，苏木素复染， 所有步骤严格按说明书进行。以已知CD137L阳性的NSCLC组织标本做阳性对照，用PBS替代一抗做阴性对照。I⑶137L在非小细胞肺癌组织中的分布及表达CD137L阳性表达定位于细胞质，部分位于细胞核，呈棕黄色或棕褐色颗粒。在61例NSCLC肿瘤组织中28例阳性，CD137L阳性表达率为45. 90%(28/61)，而邻近的5例癌旁组织中几乎未见阳性表达。2⑶137L表达与临床病理资料的关系将61肺癌患者按性别、年龄、病理、分期等分组进行分析，结果显示CD137L的表达在早期肺癌中的阳性表达率高于进展期肺癌(P=O. 027)，而与其他因素无明显相关(P>0. 05) ⑶137L的表达与患者临床病理参数的关系权利要求1.CD137L在制备治疗非小细胞肺癌药物中的应用。全文摘要CD137L在制备治疗非小细胞肺癌药物中的应用；本专利技术首次提出CD137L可以治疗肺癌，特别是非小细胞性肺癌，为开发相关药物，作为药物筛选本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
...
【专利技术属性】
技术研发人员：束永前，郭人花，殷咏梅，武常玲，承婷，
申请(专利权)人：江苏省人民医院，
类型：发明
国别省市：
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