提供了制备植物来源之病毒样颗粒(virus?like?particle，VLP)的方法。该方法可包括获取包含定位于质外体(apoplast)之VLP的植物或植物物质，从所述植物或植物物质产生原生质体(protoplast)/原生质球(spheroplast)级分和质外体级分，以及回收质外体级分。质外体级分包含植物来源的VLP。或者，可以通过用细胞壁降解酶组合物消化植物物质来产生消化级分，从而从包含植物来源之VLP的植物或植物物质获得VLP。过滤消化级分以产生过滤级分，从过滤级分中回收植物来源的VLP。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及制备植物来源的病毒样颗粒(virus like particle, VLP)的方法。
技术介绍
目前宿主细胞(如大肠杆菌、昆虫细胞培养物和哺乳动物细胞培养物)中的重组表达策略在培养基中以非常高的水平表达和分泌蛋白质。使用这些系统获得了高水平表达、正确蛋白质折叠和蛋白质翻译后修饰。此外，由于可以容易地将细胞内蛋白质与其他组分(DNA、囊泡、膜、色素等)分离，所表达蛋白质的纯化得以简化。对于植物或酵母表达系统，细胞壁阻止表达的蛋白质分泌到培养基中。对抗病毒感染的一种主要方法是通过免疫接种。应对流行爆发或满足季节性需求(例如，每年秋季发生的“流感季”或最近全球爆发的“猪流感”)的疫苗生产需要在获知后短时间内生产足量的疫苗。在面对全球流感大流行时，目前全球的流感疫苗产量可能不足。此外，主导(dominant)流感毒株每年变化，因此在一年中的低需求时间中储备是不实际的。经济、大规模地生产有效的流感疫苗有显著价值。病毒样颗粒(VLP)可用于制备流感疫苗。超结构(suprastructure)(如VLP)模拟病毒衣壳结构，但缺少基因组，从而不能复制或提供再次感染。VLP刺激强免疫应答，为分离(可溶)的重组抗原提供了替代方法。VLP在特定病毒蛋白表达后进行组装并具有类似于其同类病毒的外表面，但不同于真的病毒颗粒，遗传物质不会整合到其中。与天然病毒类似的颗粒状多价结构抗原的呈递引发具有均衡的体液和细胞成分的增强的免疫应答刺激。 认为优于分离抗原产生之刺激的这种改进对于包膜病毒尤其适用，因为包膜VLP以其天然膜结合状态呈递表面抗原(Grgacic和Anderson，2006年，Methods 40，60-65)。此外，已证明与重组血凝素(HA)(即单体HA，或组成花环的HA;3-8个三聚体的HA组装物)相比， 拥有纳米颗粒组织结构的流感VLP是更佳的候选疫苗，并且他们能激活体液和细胞免疫应答。(Bright，R.A.，等，2007，Vaccine 25,3871-3878)。目前市场上的绝大部分流感疫苗由从蛋中培养之病毒粒获得的病毒颗粒或病毒抗原构成。来源于蛋的疫苗的生产依赖于在具有胚胎的鸡蛋中培养活病毒。在用去污剂化学灭活和破坏纯化的病毒粒后获得裂解流感疫苗。作为大流行性疫苗产品，重组流感抗原是病毒来源抗原的有效替代品。一旦可获得新毒株的遗传构成信息，可以使用该信息生产重组抗原，并且其允许快速启动生产过程。但是，与灭活的裂解流感疫苗相比，纯化的重组HA亚基表现出更低的效力，并且需要更高的抗原含量来产生强免疫应答(Treanor等， 2007，J. Am. Med. Assoc. 297，1577-1582)。已通过在培养的哺乳动物细胞中共表达全部10种流感病毒蛋白获得流感 VLP (Mena等，1996年，J. Viro 1. 70，5016-5024)。几种病毒蛋白对于VLP的生产是可缺省的， 而且在疫苗发展中已通过共表达2种主要抗原性包膜蛋白(HA和NA)以及Ml或者仅共表达 HA 和 Ml 生产流感 VLP (Kang 等，2009 年，Virus Res. 143，140-146)。Chen 等(2007 年， J. Virol. 81,7111-7123)证实单独的HA可以驱动VLP形成和出芽，在他们的系统中可以省去Ml共表达。但是，由于发现HA与产生VLP的哺乳动物细胞表面的唾液酸化糖蛋白结合，所以共表达了病毒唾液酸酶以使VLP在出芽后从生产细胞中释放。期望有更简单的VLP生产系统(例如依赖于表达仅一种或几种病毒蛋白质而不需要表达非结构病毒蛋白的生产系统)以加快疫苗的开发。在植物系统中生产病毒抗原(包括VLP)提供了这样的生产优势，既它们可以在温室或田间培养，不需要无菌组织培养法和处理。PCT公开WO 2006/119516 (Williamson和Rybicki)公开了在植物中表达流感病毒A/越南/1194/2004的全长和截短的人密码子优化H5HA。截短的构建体缺少膜锚定结构域。通过靶向ER的构建体获得最高的HA蛋白积累。缺少膜靶向结构域的构建体没有产生可检测的HA。没有报道VLP的生产情况。之前WO 2009/009876和WO 2009/076778的专利技术人已描述了包含脂质包膜的流感 HAVLP的生产(D’ Aoust等；两者均通过引用并入本文)。对于包膜病毒，病毒保留脂质层或膜可以是有利的。不同系统的脂质构成可以有所不同(例如植物生成的包膜病毒会在包膜中包含植物脂质或植物留醇)，这可有助于增强免疫应答。Mason等描述了表达HBV表面抗原(HBsAg)的转基因烟草中包膜VLP的组装 (1992 年，Proc. Natl. Acad. ki. USA 89,11745-11749)。已证明植物生成的 HBV VLP 在肠胃外施用时在小鼠中显示出诱导强B和T细胞免疫应答((Huang等，2005年，Vaccine 23， 1851-1858)，但饲喂实验的口服免疫仅诱导了中度的免疫应答(Smith等，2003年，Vaccine 21,4011-4021)。Greco (2007 年，Vaccine 25,8228-8240)证明与 HBsAg 融合的人免疫缺陷病毒(HIV)表位在转基因烟草和拟南芥(Arabidopsis)中表达时累积为VLP，产生了二价 VLP疫苗。在转基因烟草和马铃薯植株中表达病毒衣壳蛋白(NVCP)导致无包膜VLP的组装 (Mason 等，1996 年，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93，5335-5340)。已在农杆菌浸润的本塞姆氏烟草(N. benthamiana)叶中产生了 NVCP VLP (Huang等 2009年，Biotechnol. Bioeng. 103， 706-714)，并且在小鼠中证实了其口服施用后的免疫原性(Santi等，2008年，Vaccine26, 1846-1854)。给健康成人志愿者施用含有215-751 μ gVLP形式的NVCP的2或3剂量生马铃薯在95%的免疫志愿者中产生免疫应答(Tacket等2000年，J. Infect. Dis. 182，302-305)。 还由 HBV 核心抗原(HBcAg ；Huang 等，2009 年，Biotechnol. Bioeng. 103，706-714)、人乳头状瘤病毒(HPV)主要衣壳蛋白 Ll (Varsani 等，2003 年，Arch. Virol. 148，1771-1786)的表达获得了无包膜VLP。可期望在将VLP用于疫苗制备之前从植物或植物物质中存在的一些或全部蛋白质、碳水化合物等中分离VLP。PCT公开WO 00/09725 (Turpen等)描述了一种从植物的细胞间隙提取蛋白质的方法，包括真空和离心处理以提供包含目的蛋白质的间质液 (interstitial fluid)提取物。该方法适于能在真空和离心条件下通过孔的小蛋白质 (50kDa或更小)，但不适于较大超级结构蛋白(superstructure protein)或蛋白复合物如 VLP。1999 年 McCormick 等(Proc Natl Acad Sci USA 本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：路易斯菲利普·韦齐纳，马农·科图雷，达尼·帕克特，米凯莱·达吉斯，马克安德烈·德奥斯特，
申请(专利权)人：麦迪卡格公司，
类型：发明
国别省市：
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