本发明专利技术涉及基因工程领域，具体为一种对日本血吸虫病肝纤维化具有治疗作用的DNA疫苗及其应用。利用自行研制的具有免疫靶向和抗血吸虫卵胚作用的单链抗体scFv，将其与细胞因子IL-18融合，利用特异性单链抗体的免疫靶向作用和抗血吸虫卵卵胚的作用，结合IL-18的免疫调理，增强了对血吸虫病肝纤维化的治疗效果。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程领域，具体涉及一种对日本血吸虫病肝纤维化具有治疗作用的DNA疫苗及其应用，此种DNA疫苗可直接用于动物试验。
技术介绍
血吸虫病(schistosomiasis)是一种流行广泛、严重危害人类健康和社会经济发展的人畜共患寄生虫病。全球每年死于血吸虫病的人数超过2万。在我国流行的是日本血吸虫病。日本血吸虫(Schistosoma Japonicum, Sj)致病的主要原因是雌虫所产的大量虫卵沉积于肝、肠等组织中，形成虫卵肉芽肿、组织损伤和继发性肝纤维化，肝纤维化可进一步导致门脉高压综合症如食管胃底静脉曲张、肝脾肿大和脾功能亢进，患者可因并发上消化道出血、肝性昏迷及结肠息肉癌变等严重病症而致死。目前，血吸虫病疫苗的研究绝大多数集中在抗感染等预防性疫苗的研究上，而针对已经感染者，治疗性疫苗的研究则极少见。血吸虫感染人体后，雌虫产出虫卵为未成熟虫卵，部分沉积于肝脏，经过初产期、空泡期、胚胎期发育至成熟虫卵约需11日，虽然临床上可以使用高效的抗虫药吡喹酮杀虫治疗，但吡喹酮只能杀灭3d以上的童虫、成虫，而肝脏内的未成熟虫卵仍可继续发育，并引起组织内虫卵肉芽肿反应，目前血吸虫性肝纤维化研究的重点在于对已经形成的纤维化的治疗，尚无针对吡喹酮杀虫后由未成熟虫卵引起的肉芽肿反应的治疗方法。且血吸虫病患者发现时多已转为慢性，体内早已形成肉芽肿或肝纤维化，杀虫后病人依然有晚期转化的可能，虫卵等抗原的免疫病理反应并不因杀虫治疗而终止。因此，在血吸虫病患者杀虫化疗后，如何有效应对那些已经沉积在肝内的虫卵尤其是未成熟虫卵所产生的免疫病理反应而导致的肝纤维化的进一步发展则成为当务之急。现已证实，细胞免疫和体液免疫均参与日本血吸虫病性肝纤维化的发生、发展， 并以细胞免疫为主。肝纤维化的主要病理改变为血吸虫卵抗原的持续刺激引起TH2型反应持续存在，导致肝星状细胞异常激活转化为肌成纤维细胞并大量增殖，产生的细胞外基质(ECM)超过了机体的降解能力，致使ECM在肝内过量沉积。在肝肉芽肿、纤维化形成过程中，THZffl2极化及其免疫调节起到非常重要的作用。现已普遍认为TH1类细胞因子可以抑制肝星状细胞的增殖和胶原蛋白的合成。TH1类细胞因子中与抗纤维化作用相关主要有IFN-y、IL-12、IL-18。IL-18又名IFN-γ诱导因子，能强烈诱导NK细胞、T细胞产生 IFN-γ。Feng Wei等将含小鼠IL-18的质粒pVAX/IL-18与含日本血吸虫14kDa脂肪酸结合蛋白(SjFABP)的质粒pVAX/SjFABP、含日本血吸虫^kDa谷胱甘肽S转移酶(SB6GST) 的质粒pVAX/Sj26GST联合免疫小鼠。结果发现，联合注射pVAX/IL_18组均显著增加了 IFN- γ和IL-2产物，指示着IL-18能加强Th-I优势性免疫反应。^iang等将IL-18基因修饰的肝细胞经脾移植入感染日本血吸虫尾蚴的小鼠后，发现IL-2、IFN-Y的表达水平明显升高，而IL-4、IL-10表达水平却显著降低，形成典型的Th1型免疫应答。感染20周后， 检测发现羟脯氨酸等表达水平降低，肝脏I、III型前胶原、羟脯氨酸及胶原含量明显降低，说明IL-18可诱导日本血吸虫感染慢性期从促进肉芽肿、肝纤维化形成的Tti2型免疫应答转化为抗纤维化的Th1型应答优势，提示通过IL-18调控ThZft2极化的方向可减轻虫卵肉芽肿和肝纤维化的反应强度，以达到干预治疗肝纤维化的目的。目前抗纤维化治疗着力于消除和抑制炎症的发生发展，尚无有效治疗能明显改善或逆转纤维化相关的炎症进程。TH1细胞因子能直接抑制成纤维细胞的胶原合成，说明TH1 细胞因子是一种潜在的抗纤维化治疗靶点，其中能明显改善感染肝脏纤维化且已应用于临床的TH1细胞因子有IFN- γ。然而传统的细胞因子免疫治疗是将利用生物工程技术生产的细胞因子注入患者体内，通过血液循环到达免疫原局部而起作用，这种治疗必需连续、大剂量用药，这势必导致毒副作用增加及宿主体内细胞因子严重失衡。因此，理想的治疗方法是即能有效的利用此类细胞因子进行抗肝纤维化治疗，同时又能将其导致的毒副作用和其它部位正常组织的细胞因子失衡减至最低。单链抗体(single chain Fv antibody, scFv)作为基因工程抗体的一种，是具有完整抗原结合位点的最小功能片段，与完整抗体比较，具有更大的优越性分子量小，免疫原性低，组织穿透力强，定位迅速，清除快，易于基因工程制备和改造等，目前已有多种单链抗体用于肿瘤的临床检测，取得了较满意的效果。而且已有多个人源性单链抗体获美国FDA 的批准，但目前尚无单链抗体用于血吸虫病治疗的报道。本课题组利用噬菌体展示技术构建了日本血吸虫未成熟虫卵可溶性抗原单链抗体库，集落挖掘法从中筛选得到一株与天然分子候选疫苗SIEA^5-28kDa特异性结合的scFv，通过大肠杆菌表达系统诱导可溶性单链抗体高效表达，并将增强型绿色荧光蛋白(Enhanced Green Fluorecence Protein, EGFP) 与特异性SIEA^-28kDa单链抗体进行融合表达，通过对EGFP的绿色荧光检测显示，特异性单链抗体能与未成熟虫卵及雌虫生殖系统特异性结合，结合部位主要在未成熟卵卵胚、 雌虫卵黄腺、卵巢及与生殖系统邻近的肠壁内膜，与运用亲本抗体检测结果相似。Western blotting检测也发现此scFv蛋白不仅能与SIEA，而且能与成熟虫卵可溶性抗原(SEA)和成虫抗原(AWA)特异性结合，说明此scFv对日本血吸虫从雌成虫到未成熟虫卵、成熟虫卵各个阶段都具有高特异性靶向免疫识别能力。随后，我们利用高度纯化的scFv为探针筛选日本血吸虫尾蚴cDNA文库，获得两个编码SIEA^-28kDa疫苗候选分子的基因，通过构建真核重组质粒免疫小鼠，获得了较好的抗日本血吸虫感染的免疫保护效果。证实了此抗 SIEA26-28kDa的scFv具有潜在应用价值。细胞因子融合蛋白(cytokine fusion protein)技术是当今疾病免疫研究的一个热点方向。该方法是利用基因工程技术将两种或多种具有相同或相关功能活性但各自作用靶点不同的细胞因子融合在一起，使融合基因表达的产物既具有各因子独特的生物学活性或使其某些活性显著提高，又可能通过协同效应发挥出较单一细胞因子简单配伍所不具备的复合生物学功能。在此基础上，将抗体分子的片段与细胞因子融合，表达的融合蛋白不但可以保留抗体分子片段与抗原特异性结合的特性，还具有细胞因子的多功能免疫学活性， 从而可借助抗体将细胞因子导向到特定的靶部位发挥高效生物学功能，同时减轻全身毒副作用。Heuser等构建了抗黏蛋白的scFv-Fc-IL-2融合蛋白(C595scFv-Fc-IL_2)，证实此融合蛋白能同时特异性地结合MUCI+的肿瘤细胞和CD25+的免疫效应细胞。Halin等采用抗纤连蛋白(fibronectin，FN)的scFv L-19与IL-12融合，发现应用该融合蛋白治疗比应用等量的IL-12具有更强的抗转移效应。Helguera等将鼠GM-CSF与HER2抗体融合，观察到该融合蛋白既保持了与人HER2/neU抗原的特异性结合能力，同时也保持了与重组鼠 GM本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：汪世平，田智，周云飞，何卓，尹铁球，张树菊，冯其梅，
申请(专利权)人：中南大学，
类型：发明
国别省市：
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