本发明专利技术涉及一种农产品中微量吡虫啉残留的酶联免疫检测试剂盒。它含有包被纯化的抗吡虫啉单克隆抗体、过氧化物酶标记的RaMIgG-HRP、酶反应的底物溶液、反应终止液和残留样本预处理材料等。该试剂盒在8.30×10-6mg/mL~5.32×10-4mg/mL的吡虫啉浓度范围内与对应的抗体抑制率线性关系良好，采用简易样本前处理程序，获得的残留检测样本中吡虫啉的添加回收率平均大于87.0%（CV＜10.0%），方法的最低检测限为8.00×10-6mg/mL，且与结构类似的常用氯化烟碱杀虫剂无交叉反应。该试剂盒为农产品中的残留吡虫啉研究提供了有效的检测手段。抗吡虫啉抗体为单克隆抗体，偶联吡虫啉的载体蛋白为牛血清白蛋白BSA或鸡卵清白蛋白OVA或匙孔血蓝蛋白KLH。本发明专利技术的试剂盒具有特异性强，灵敏度高，简便，直观，准确，适用范围广，成本低，易于推广应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于免疫化学检测领域，涉及一种快速检测微量氯化烟碱杀虫剂吡虫啉的酶联免疫检测试剂盒。二、技术背景1978年在瑞士苏黎世举行的国际纯粹化学与应用化学协会(IUPAC)年会上，Soloway 等报道了一类称为硝基甲撑杀虫剂的新化合物，并指出这类化合物中杀虫活性最高的是硝基噻嗪(N i t h i a ζ i η e )，但由于硝基噻嗪分子中的2 -硝基亚甲基遇光易分解，致使 Nithiazine没有完全市场化，因此，其未能大范围服务于农业生产。20世纪80年代后期， 日本科学家以Nithiazine为先导结构，通过和硝基胍建立桥偶联，引入含氮原子的芳杂环甲基，作为2-硝基亚甲基-咪唑烷五元环或六元环系列的N-取代化合物，再通过杂环上官能团转换，获得了一系列结构衍生物，通过杀虫活性测定，发现活性最高的是硝基亚胺类化合物，该类化合物经过在世界各地的大田实验，发现其中的的吡虫啉(Imidacloprid，IMI) 在杀虫活性、光稳定性、低毒性和广泛使用性等方面表现突出，1991年英国布莱顿作物保护会议上IMI作为杀虫剂被首次介绍，当年即投入商业化生产。IMI是新型氯化烟碱类杀虫剂中的第一个品种，也是代表品种。目前已成功开发出的剂型包括可湿性粉剂(WP)、微胶囊剂 (GG)、乳油(EC)、可溶性液剂(SL)、可溶性粉剂(SP)五大系列，共计70余个产品。目前，含 IMI的杀虫剂产品已在120余个国家的140余种农作物上获得登记，其应用范围涉及粮食、 经济、果树、茶叶和蔬菜等60余种作物，防治对象涉及同翅目、鞘翅目和鳞翅目等7个目50 多种害虫。IMI以昆虫烟碱型乙酰胆碱受体(nAchR)为分子靶标，IMI与该受体结合，会造成因IMI刺激引起的神经冲动电传导受阻，导致昆虫异常兴奋、痉挛、身体摇晃至衰竭死亡等中毒症状。研究发现IMI对环境生物，如蜜蜂、家蚕均有极高的胃毒和触杀毒性，且其代谢产物去硝基吡虫啉(Desniero-Lnidacloprid，DN-IMI)对蜜蜂也表现为高毒。目前因IMI 使用不当，造成的大面积蜜蜂、家蚕中毒事件时有发生。IMI对水生生物(如鱼、虾、蝌蚪、青蛙)、土壤有益生物(如蚯蚓)虽属中等毒性，但在一定剂量范围内均显示出一定程度的遗传毒性，且其水解产物和光解产物与IMI原药有类似的生态效应。此外，IMI除对一些天敌生物表现出直接毒性外，对一些天敌生物还具有明显的亚致死效应。不仅会使其产卵量减少、 寿命缩短，而且其功能性反应参数也会显著改变，即明显降低其对寄主的搜索能力。尤其值得注意的是，国外学者近年来报道了 IMI在高等动物体内有明显的慢性蓄积毒性、对人类的遗传毒性和潜在的影响学习和影响记忆的效应。目前关于IMI残留的检测方法主要是仪器方法，包括高效液相色普法(HPLC)、气相色谱质普联用法(GC-MS)和液相色谱质普联用法(LC-MS)等，这些方法虽然表现出检出灵敏度高和特异性强等优势，但残留样本需要经过繁琐费时的预处理程序(样品提取和净化)；同时这类检测方法需要大型的专门检测仪器设备、专门的实验室和高水平的专业技术人员操作，无法进行现场检测，时效性差，难以推广。残留物的生物技术检测方法主要是酶抑制法(EIA)和酶联免疫吸附测定法(ELISA)0 EIA技术主要是利用农药对胆碱酯酶活性有抑制作用的原理，酶与底物反应后， 通过比色法测定酶抑制率，来判定农药残留是否超标。但EIA的应用有很大的局限性，存在着只能用来检测有机磷酸酯类和氨基甲酸酯类农药、假阳性或假阴性检测结果出现的概率比较大、难以从多残留样本中检测单一农药、不能定性、只能粗略定量等技术问题。以竞争性酶联反应为检测原理的ELISA检测技术在以上几方面则有明显优势，反应结束后用酶标分析仪测相应的OD值，OD值越低表示被检样本中的残留样品含量越高，且节省时间、费用低，定性和定量同时进行，基于单克隆抗体的ELISA几乎不会出现假阳性或假阴性现象。但由于ELISA是一种灵敏度很高的检测方法，不同的操作者往往会出现不同的检测结果，所以该方法常常造成人为的误检和漏检。因此，基于ELISA原理物化出来的标准化、程序化检测产品的研制开发就显得尤为必要。目前IMI残留免疫学检测试剂盒的开发在国内尚属空白，急待研究解决。
技术实现思路
本专利技术的目的研制并开发出特异性强、灵敏度高、操作便捷、经济实用的农产品中微量IMI残留快速检测试剂盒。本专利技术的技术方案是本专利技术含有吡虫啉包被抗原AET-IMI-0VA包被并封闭好的96孔酶标反应板，用于研磨植物组织的石英砂，工作浓度的抗吡虫啉单克隆抗体，工作浓度的酶标记二抗GaMIgG-HRP， 底物缓冲液，反应终止液，洗涤缓冲液，工作浓度的阴性血清和用于制作标准曲线的系列浓度的吡虫啉标准溶液，其中酶标记二抗为辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠RaMIgG-HRP ； 偶联IMI人工半抗原的载体蛋白为牛血清白蛋白BSA，或鸡卵清白蛋白0VA，或匙孔血蓝蛋白 KLH。本专利技术的有益效果是1.特异性强，灵敏度高。本专利技术试剂盒以强特异性和高亲和力的IMI-mAb为基础制备而成，具有较强的特异性和较高的灵敏度，其在8. 30 ΧΙΟ"6 mg/mL^5. 32X10_4 mg/mL的 IMI浓度范围内与对应的抑制率线性关系良好(R2=O. 997)，采用简易样本前处理程序，获得的残留检测样本中IMI的添加回收率均大于75.0% (CV < 10.0%)，方法的最低检测限为 8. OOXlO-6 mg/mL，且与结构类似的常用氯化烟碱杀虫剂无交叉反应(CR < 0. 05%)。本专利技术在保障农产品质量安全，保护消费者健康方面具有极其重要的意义。2.简便、快速。使用本专利技术试剂盒，无需其它任何试剂和仪器，可现场操作。只要将残留样本经过方法所述的简单预处理，在30分钟内即可判定检测结果。3.结果显示形象、直观、准确。本专利技术试剂盒以显色反应为定性和定量标准，通过与标准比色卡比对，根据显色反应作为检测结果阳性和阴性标记，结果判定形象、直观、准确，简单明了，不易出现假阳性和假阴性等人为误判。4.节省费用。使用该试剂盒，无需另配仪器设备和其它试剂，可能随时随地进行检测，费用低廉，节省大量贵重仪器及设备费用。5.适用范围广，便于推广应用。该试剂盒操作简便，能满足不同层次人员需要，包括专业化验、海关检疫、卫生检疫、质量监测、农产品加工、以及消费者个人等，具有广阔的市场前景和明显的经济、社会效益。具体实施例方式要制成快速检测微量IMI的检测试剂盒，首先要把IMI与载体蛋白有效偶联，通过按既的免疫程序免疫试验动物产生多克隆抗体，然后采用细胞融合技术制备其杂交瘤细胞，从而筛选和制备IMI-mAb，其次需制备小鼠IgG抗体，最后通过建立间接竞争ELISA模式，即可用于样品检测。1. IMI与载体蛋白偶联首先以IMI原药和β -巯基丙酸为起始原料，在热碱作用下通过亲核取代反应，合成出 IMI人工半抗原，再采用碳二亚胺法(EDC)将IMI与载体蛋白进行偶联制备人工结合抗原。第一步缩合反应引入羧基，用40 mL DMSO在反应烧瓶中溶解9 g原药(经过重结晶提纯)，加入4 g Κ0Η。搅拌下将4 mL β-巯基丙酸缓慢滴加至反应烧瓶，本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：石洪波，王自良，张海棠，
申请(专利权)人：石洪波，
类型：发明
国别省市：
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