本发明专利技术涉及植物基因工程领域，提供了一种大豆食心虫18srDNA基因，其碱基序列如SEQ?ID?NO：1所示。体外合成大豆食心虫18srDNA基因的dsRNA，利用显微注射技术将大豆食心虫18srDNA基因dsRNA导入到一龄末大豆食心虫幼虫体内，结果证明：注射18srDNA的dsRNA能够引起大豆食心虫幼虫体内18srDNA基因沉默从而对大豆食心虫幼虫的生长发育产生影响，甚至导致大豆食心虫幼虫的死亡。该基因可以作为靶基因用于构建RNAi表达载体，用于培育高抗大豆食心虫大豆种质。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及植物基因工程领域，尤其涉及一种大豆食心虫ISsrDNA基因及其应用。
技术介绍
大豆食心虫(Leguminivora glycinivorella(Mats. Obraztsov))是我国东北大豆产区发生最严重的一种虫害，主要是幼虫蛀入豆荚危害豆粒。一般年份虫食率10% 20 %，重害年份30% 40 %，个别年份超过50 %以上。造成被害豆粒不完整或破粒，降低大豆产量和品质。黑龙江是我国大豆之乡，大豆种植面积占全国的33. 2 %，占东北的64%， 总产量占全国的37. 3%，在我国大豆生产中起着举足轻重的作用。但近年来由于气候变化和“豆麦产区”小麦种植面积逐年减少，重迎茬大豆种植比例逐渐增力卩，致使大豆食心虫发生加重。据黑龙江省植保站统计2009年黑龙江省大豆食心虫的发生面积为1720. 5万亩； 2010年大豆食心虫的发生面积为1383. 7万亩。黑龙省每年大豆种植面积都在6000万亩左右，接近1/3大豆田遭受不同程度的害虫侵害，不仅使大豆田严重减产，而且降低大豆商品质量使大豆优质率只有50% -60%，严重影响其在国际市场的竞争力。为了减少害虫对大豆产量和品质的危害，以黑龙江为例，豆农每年至少使用2次化学杀虫剂对大豆食心虫和草地螟进行防治。现在使用的化学杀虫剂都是广谱性杀虫剂，不仅杀死目标昆虫，而且杀死有益昆虫，同时化学杀虫剂在自然界可以长期存在，在土壤和河流中逐渐积累，破坏土壤和河流的生态环境；化学杀虫剂还可以通过食物链进入人体，诱发致畸、致癌、严重损害人体健康。因此各种不必利用化学农药来防治大豆害虫的方法日益受到重视。转苏云金杆菌(Bacillusthuringiensis，简称Bt)抗虫基因虽为害虫防治一度带来了希望，并在抗虫棉的应用上获得了举世瞩目的成果。培育抗大豆食心虫的大豆品种的传统育种方法虽然有效，但周期长，效率低。所以，现在需要建立一种防治大豆食心虫的新方法，能够更精确、更高效的控制大大豆食心虫，加快我国抗大豆食心虫育种研究速度。RNA干扰是利用外源导入或转录载体在体内转录的双链RNA介导受体细胞中的序列特异的同源性mRNA发生降解或翻译受阻，引发受体细胞产生转录后基因沉默，使与此相应的内源靶基因的表达被阻抑，从而得到类似于“基因敲除”的基因阻抑效果。显微注射法是RNAi研究中最广泛使用的dsRNA导入方法，该方法在蟋蟀G. bimaculatus、拟谷盗 Tribolium castaneum、家香Bombyx mori、舌甘菜液蛾S. exigua、褐飞風Nilaparvata Iugens 等昆虫中均取得成功。但显微注射法dsRNA方法只能用于研究昆虫基因功能，不能采用该方法在田间对害虫进行防控。如果利用植物表达与昆虫生长关键基因匹配的dsRNA分子， 当昆虫取食这类植物后，将这些dsRNA摄入体内，在昆虫体内发生RNA干扰现象，使关键基因的表达被明显抑制，从而达到控制害虫的目的。这就是利用RNA干扰技术防治害虫的基本过程。RNA干扰利用的是基因片段，在转录后诱导相应靶基因沉默，与常规转抗虫基因相比，RNA干扰介导的昆虫基因沉默不产生新的蛋白质，具有更高的生物安全性。由于该方法具有高效、特异、安全等特点，被认为是一种非常具有前途的控制害虫的新方法，能够更好的防治那些以农作物为食、影响农作物产量的害虫，是农作物害虫防御领域的突破。而且， 目前国内外尚无利用RNA干扰防治大豆食心虫的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种编码大豆食心虫18srDNA的基因，其碱基序列如SEQ ID NO 1 所示。本专利技术的第二个目的在于提供一种含有大豆食心虫ISsrDNA基因的载体。本专利技术的第三个目的在于提供大豆食心虫ISsrDNA基因在提高大豆抗食心虫能力中的应用。本专利技术的第四个目的在于提供一种提高大豆抗食心虫能力的方法，将大豆食心虫 ISsrDNA基因导入大豆组织或细胞，得到食心虫抗性提高的大豆，所述大豆食心虫ISsrDNA 基因的核苷酸序列如如SEQ ID N0:1所示。所述大豆食心虫18srDNA基因通过含有所述大豆食心虫18srDNA基因的载体导入植物组织或细胞。本专利技术的技术路线为1)利用分子生物学方法克隆大豆食心虫ISsrDNA基因；2)体外合成大豆食心虫18srDNA基因的dsRNA，利用显微注射技术将大豆食心虫 18srDNA基因dsRNA导入到一龄末大豆食心虫幼虫体内，结果证明注射18srDNA的dsRNA 能够引起大豆食心虫幼虫体内ISsrDNA基因沉默从而对大豆食心虫幼虫的生长发育产生影响，甚至导致大豆食心虫幼虫的死亡。本专利技术克隆了一种大豆食心虫18srDNA基因，体外合成大豆食心虫18srDNA基因的dsRNA，利用显微注射技术将大豆食心虫18srDNA基因dsRNA导入到一龄末大豆食心虫幼虫体内，结果证明注射18srDNA的dsRNA能够引起大豆食心虫幼虫体内18srDNA基因沉默从而对大豆食心虫幼虫的生长发育产生影响，甚至导致大豆食心虫幼虫的死亡。该基因可以作为靶基因用于构建RNAi表达载体，用于培育高抗大豆食心虫大豆种质。附图说明图1大豆食心虫18srDNA基因的PCR产物琼脂糖凝胶电泳图，M :DL2000DNA分子量标准，1 :18srDNA的PCR产物；图2根据昆虫ISSrDNA序列用相邻连接(NJ)法构建系统发生树；图318SrDNA在大豆食心虫不同发育阶段的表达模式；图418SrDNA在大豆食心虫不同组织的表达模式；图518srDNA体外合成的dsRNA电泳检测结果图，a) M =DNA分子量标准；1_3 18srDNA 的 dsRNA ；图6注射不同浓度18srDNAdsRNA对大豆食心虫幼虫死亡率的影响；图7注射不同浓度dsRNA对大豆食心虫幼虫18srDNAmRNA表达水平的影响；图8注射18rDNA dsRNA对大豆食心虫幼虫死亡率的影响；图9注射18rDNAd sRNA对大豆食心虫幼虫体重的影响；图10注射18rDNA dsRNA对大豆食心虫幼虫发育的影响；图1118SrDNA目的片段的PCR扩增产物；图12(a)BP反应的PCR鉴定结果，M :DNA标准；1-3BP转化子PCR扩增产物；4 ddH20 ；图12(b) LR反应的PCR鉴定结果，M :DNA标准；l_4intronA和引物6PCR扩增产物；图13RNAi植物表达载体pJawohl8_18SrDNARNAi的构建流程图。具体实施例方式以下结合具体实施例对本专利技术的技术路线做进一步详细说明。实施例1大豆食心虫18srDNA基因克隆及序列分析根据文献报道的6个昆虫的18srDNA基因的全序列，利用DNAMAN软件进行分析， 设计了覆盖了 ISSrDNA的全部序列的2个特异引物18srDNA 引物 1 :5_T (AC) CCTCGT (GT)GATCCTGCCAGT-3‘； 18srDNA 引物 2 :5_CATCCTTC(CT)GCAGGTTCACCT-3‘。以大豆食心虫基因组为模板进行PCR的扩增，95 V 5min, 57. 1 V 1. Omin, 72°C 2. 0min，30循环，最后72°C延伸IOmin0用引物1和引物2进行PCR反本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：孟凡立，王志坤，韩英鹏，李文滨，
申请(专利权)人：东北农业大学，
类型：发明
国别省市：
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