通过针对DMD家族的天然反义转录物的抑制治疗肌营养蛋白家族相关疾病制造技术

本发明专利技术涉及反义寡核苷酸，其调节肌营养蛋白家族的表达和/或功能，尤其是通过靶向肌营养蛋白家族的天然反义多核苷酸。本发明专利技术也涉及这些反义寡核苷酸的鉴定及其在治疗与DMD家族表达有关的疾病和病症中的应用。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】专利
本申请要求于2009年5月8日提交的美国临时专利申请号61/176,594、和2010年3月25日提交的美国临时专利申请号61/317,350的优先权，其整体引入本文作为参考。本专利技术的实施方案包括调节DMD家族和相关分子的表达和/或功能的寡核苷酸。专利技术背景DNA-RNA和RNA-RNA杂交对于核酸功能的许多方面是重要的，包括DNA复制、转录和翻译。杂交对于检测特定核酸或改变其表达的各种技术也是关键的。反义核苷酸例如通过与靶RNA杂交破坏基因表达，由此干扰RNA剪接、转录、翻译和复制。反义DNA具有DNA-RNA杂交物充当用于通过核糖核酸酶H消化的底物的附加特征，其是在大多数细胞类型中存在的活性。反义分子可以递送到细胞内，如对于寡聚脱氧核苷酸（ODNs）的情况，或它们可以由内源基因表达为RNA分子。FDA近期批准了反义药物VITRAVENE?（用于治疗巨细胞病毒视网膜炎），反映反义物具有治疗效用。概述提供这个概述以呈现本专利技术的概述，以简要指出本专利技术的性质和主旨。它的提出伴随将不用于解释或限制权利要求范围或含义的理解。在一个实施方案中，本专利技术提供了用于抑制天然反义转录物的作用的方法，其通过使用靶向天然反义转录物的任何区域的一种或多种反义寡核苷酸，导致相应有义基因的上调。本文还考虑天然反义转录物的抑制可以通过siRNA、核酶和小分子来达到，这被视为在本专利技术的范围内。一个实施方案提供了在体内或体外调节患者细胞或组织中的DMD家族多核苷酸的功能和/或表达的方法，其包括使所述细胞或组织与长度5 – 30个核苷酸的反义寡核苷酸接触，其中所述寡核苷酸与多核苷酸的反向互补体具有至少50％序列同一性，所述多核苷酸包括在SEQ ID NO：3的核苷酸1-378、SEQ ID NO：4的核苷酸1-294、SEQ ID NO：5的核苷酸1-686、SEQ ID NO：6的核苷酸1-480和SEQ ID NO：7的核苷酸1-501内的5 - 30个连续核苷酸（图3）；从而在体内或体外调节患者细胞或组织中的DMD家族多核苷酸功能和/或表达。在另一个优选实施方案中，寡核苷酸靶向DMD家族多核苷酸的天然反义序列，例如SEQ ID NO：3-7中所示的核苷酸，以及关于其的任何变体、等位基因、同系物、突变体、衍生物、片段和互补序列。反义寡核苷酸的例子如SEQ ID NO：8-22中所示（图4和5）。另一个实施方案提供了在体内或体外调节患者细胞或组织中的DMD家族多核苷酸功能和/或表达的方法，其包括使所述细胞或组织与长度5 – 30个核苷酸的反义寡核苷酸接触，其中所述寡核苷酸与DMD家族多核苷酸的反义的反向互补体具有至少50％序列同一性；从而在体内或体外调节患者细胞或组织中的DMD家族多核苷酸功能和/或表达。另一个实施方案提供了在体内或体外调节患者细胞或组织中的DMD家族多核苷酸功能和/或表达的方法，其包括使所述细胞或组织与长度5 – 30个核苷酸的反义寡核苷酸接触，其中所述寡核苷酸与针对DMD家族反义多核苷酸的反义寡核苷酸具有至少50％序列同一性；从而在体内或体外调节患者细胞或组织中的DMD家族多核苷酸功能和/或表达。在一个优选实施方案中，组合物包括与有义和/或反义DMD家族多核苷酸结合的一种或多种反义寡核苷酸。在另一个优选实施方案中，寡核苷酸包括一个或多个修饰的或取代的核苷酸。在另一个优选实施方案中，寡核苷酸包括一个或多个修饰的键。在另外一个实施方案中，修饰的核苷酸包括包含硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、肽核酸、2’-O-甲基、氟或碳、亚甲基或其它锁核酸（LNA）分子的修饰的碱基。优选地，修饰的核苷酸是锁核酸分子，包括α-L-LNA。在另一个优选实施方案中，将寡核苷酸皮下、肌内、静脉内或腹膜内施用于患者。在另一个优选实施方案中，寡核苷酸在药物组合物中施用。治疗方案包括给患者施用至少一次反义化合物，然而，这种治疗可以修改为包括经过一段时间的多个剂量。治疗可以与一种或多种其他类型的疗法组合。在另一个优选实施方案中，寡核苷酸封装在脂质体中或与载体分子（例如胆固醇、TAT肽）连接。其他方面在下文描述。附图简述图1是实时PCR结果的图，显示与对照相比使用应用Lipofectamine 2000引入的硫代磷酸酯寡核苷酸处理518A2细胞后在DMD家族mRNA中的倍数变化+标准差。实时PCR结果显示，在用针对DMD家族反义BG208074设计的siRNAs中的两个处理后48 h，518A2细胞中DMD家族mRNA的水平显著增加。表示为CUR-0636至CUR-0654的条（Bars）分别对应于用SEQ ID NOS: 8-17处理的样品。图1B是实时PCR结果的图，显示与对照相比使用应用Lipofectamine 2000引入的硫代磷酸酯寡核苷酸处理518A2细胞后在DMD家族mRNA中的倍数变化+标准差。用针对其他反义分子BF838561、BF768753和BF950643的siRNAs的处理不提高DMD家族mRNA水平。表示为CUR-0638、CUR-0648、CUR-0646和CUR-0652的条分别对应于用SEQ ID NOS: 9、14、13和16处理的样品。图1C 是实时PCR结果的图，显示与对照相比使用应用Lipofectamine 2000引入的硫代磷酸酯寡核苷酸处理MCF-7细胞后在UTRN mRNA中的倍数变化+标准差。表示为CUR-1443至CUR-1447的条分别对应于用SEQ ID NOS: 18-22处理的样品。图2显示SEQ ID NO: 1: 智人肌营养蛋白家族转录物变体Dp427m, mRNA (NCBI登记号：NM_004006)SEQ ID NO: 2: 智人Utrophin (UTRN), mRNA。(NCBI登记号：NM_007124)。图3显示SEQ ID NO: 3: 天然DMD家族反义序列 (BF838561)SEQ ID NO: 4: 天然DMD家族反义序列 (BG208074)SEQ ID NO: 5: 天然DMD家族反义序列 (BF950643)SEQ ID NO: 6: 天然DMD家族反义序列 (BF768753)SEQ ID NO: 7: 天然UTRN家族反义序列 (ENST00000431309)。图4显示DMD反义寡核苷酸SEQ ID NOs: 8-17。‘r’指示RNA。图5显示UTRN 反义寡核苷酸SEQ ID NOs: 18-22。* 指示硫代磷酸酯（phosphothioate）键。图6显示DMD有义寡核苷酸SEQ ID NOs: 23-32。有义寡核苷酸SEQ ID NO: 23-32分别是反义寡核苷酸SEQ ID NO: 8-17的反向互补体。‘r’指示RNA。专利技术详述下文就用于举例说明的示例应用而言描述了本专利技术的几个方面。应当理解阐述了众多具体细节、本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2009.05.08 US 61/176594;2010.03.25 US 61/3173501.一种在体内或体外调节患者细胞或组织中肌营养蛋白家族多核苷酸的功能和/或表达的方法，其包括：
使所述细胞或组织与长度5 – 30个核苷酸的至少一种反义寡核苷酸接触，其中所述至少一种寡核苷酸与多核苷酸的反向互补体具有至少50％序列同一性，所述多核苷酸包括在SEQ ID NO：3的核苷酸1-378、SEQ ID NO：4的核苷酸1-294、SEQ ID NO：5的核苷酸1-686、SEQ ID NO：6的核苷酸1-480和SEQ ID NO：7的核苷酸1-501内的5 - 30个连续核苷酸（图3）；从而在体内或体外调节患者细胞或组织中所述肌营养蛋白家族多核苷酸的功能和/或表达。
2.一种在体内或体外调节患者细胞或组织中肌营养蛋白家族多核苷酸的功能和/或表达的方法，其包括：
使所述细胞或组织与长度5 – 30个核苷酸的至少一种反义寡核苷酸接触，其中所述至少一种寡核苷酸与肌营养蛋白家族多核苷酸的天然反义的反向互补体具有至少50％序列同一性；从而在体内或体外调节患者细胞或组织中所述肌营养蛋白家族多核苷酸的功能和/或表达。
3.一种在体内或体外调节患者细胞或组织中肌营养蛋白家族多核苷酸的功能和/或表达的方法，其包括：
使所述细胞或组织与长度5 – 30个核苷酸的至少一种反义寡核苷酸接触，其中所述寡核苷酸与针对肌营养蛋白家族多核苷酸的反义寡核苷酸具有至少50％序列同一性；从而在体内或体外调节患者细胞或组织中所述肌营养蛋白家族多核苷酸的功能和/或表达。
4.一种在体内或体外调节患者细胞或组织中肌营养蛋白家族多核苷酸的功能和/或表达的方法，其包括：
使所述细胞或组织与靶向肌营养蛋白家族多核苷酸的天然反义寡核苷酸的区域的至少一种反义寡核苷酸接触；从而在体内或体外调节患者细胞或组织中肌营养蛋白家族多核苷酸的功能和/或表达。
5.权利要求4的方法，其中相对于对照，所述肌营养蛋白家族的功能和/或表达在体内或体外增加。
6.权利要求4的方法，其中所述至少一种反义寡核苷酸靶向肌营养蛋白家族多核苷酸的天然反义序列。
7.权利要求4的方法，其中所述至少一种反义寡核苷酸靶向包括肌营养蛋白家族多核苷酸的编码和/或非编码核酸序列的核酸序列。
8.权利要求4的方法，其中所述至少一种反义寡核苷酸靶向肌营养蛋白家族多核苷酸的重叠和/或非重叠序列。
9.权利要求4的方法，其中所述至少一种反义寡核苷酸包括选自下列的一种或多种修饰：至少一种修饰的糖部分、至少一种修饰的核苷间键合、至少一种修饰的核苷酸和其组合。
10.权利要求9的方法，其中所述一种或多种修饰包括选自下列的至少一种修饰的糖部分：2'-O-甲氧基乙基修饰的糖部分、2'-甲氧基修饰的糖部分、2'-O-烷基修饰的糖部分、双环糖部分及其组合。
11.权利要求9的方法，其中所述一种或多种修饰包括选自下列的至少一种修饰的核苷间键合：硫代磷酸酯、2'-O-甲氧基乙基（MOE）、2'-氟、烷基膦酸酯、二硫代磷酸酯、烷基硫代膦酸酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯、碳酸酯、磷酸三酯、亚氨酸乙酯、羧甲基酯和其组合。
12.权利要求9的方法，其中所述一种或多种修饰包括选自下列的至少一种修饰的核苷酸：肽核酸(PNA)、锁核酸（LNA）、阿糖核酸（FANA），其类似物、衍生物和其组合。
13.权利要求1的方法，其中所述至少一种寡核苷酸包括如SEQ ID NOS：8 -22所示的至少一个寡核苷酸序列。
14.一种在体内或体外调节哺乳动物细胞或组织中肌营养蛋白家族基因的功能和/或表达的方法，其包括：
使所述细胞或组织与长度5 – 30个核苷酸的至少一种短干扰RNA（siRNA）寡核苷酸接触，所述至少一种siRNA寡核苷酸对于肌营养蛋白家族多核苷酸的反义多核苷酸具有特异性，其中所述至少一种siRNA寡核苷酸与所述肌营养蛋白家族多核苷酸的反义和/或有义核酸分子的至少约5个连续核酸的互补序列具有至少50％序列同一性；以及在体内或体外调节哺乳动物细胞或组织中肌营养蛋白家族的功能和/或表达。
15.权利要求14的方法，其中所述寡核苷酸与与所述肌营养蛋白家族多核苷酸的反义和/或有义核酸分子互补的至少约5个连续核酸的序列具有至少80％序列同一性。
16.一种在体内或体外调节哺乳动物细胞或组织中肌营养蛋白家族的功能和/或表达的方法，其包括：
使所述细胞或组织与长度约5 – 30个核苷酸的至少一种反义寡核苷酸接触，所述至少一种反义寡核苷酸对于肌营养蛋白家族多核苷酸的有义和/或天然反义链的非编码和/或编码序列具有特异性，其中所述至少一种反义寡核苷酸与如SEQ ID NOS：1、2和3 -7所示的至少一个核酸序列具有至少50％序列同一性；以及在体内或体外调节哺乳动物细胞或组织中肌营养蛋白家族的功能和/或表达。
17.一种包括至少一种修饰的合成的、修饰的寡核苷酸，其中所述至少一种修饰选自...

【专利技术属性】
技术研发人员：J科拉德，O霍尔科瓦谢尔曼，
申请(专利权)人：J科拉德，O霍尔科瓦谢尔曼，
类型：发明
国别省市：