本发明专利技术涉及将具有高吲哚-3-乙酸(IAA)含量的细菌用于溶解土地中的磷酸盐岩(phosphate?rock)，其中所述细菌通过转化能够增加IAA含量的试剂的编码基因而获得。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及将具有高水平吲哚-3-乙酸(IAA)的细菌用于农业应用，例如改善农业产量和增加植物生长肥料的可用性。
技术介绍
氮(N)和磷(P)是植物生长的主要限制因素。一些微生物改善N和P的摄取和可用性，使化学肥料依赖性最小。与别的主要营养如氮相比，磷(P)是迄今多数土地情况中最少移动和植物可利用的。尽管土壤中富含有机和无机形式的P，但其经常是植物生长主要甚至首要的限制因素。 全世界许多土壤是缺乏P的，因为即使是在肥沃的土壤中，游离浓度(植物可利用的形式) 通常仍较低，这是由于可溶性P与钙、铁或铝的高反应活性导致P沉淀(36，41)。此外由于成本限制，在发展中国家中没有广泛使用提供三种主要植物营养(N、P和钾)的化学肥料。 在这些地区，磷酸盐岩(Phosphate Rock, PR)的直接应用越来越多，即使I3R释放的P通常对于作物生长来说太少(9，38)。已知许多微生物，特别是假单胞菌属(Pseudomonas)、杆菌属(Bacillus)和根瘤菌属(Rhizobium)，具有改变它们代谢的能力以响应细胞生长可用的磷。代谢的转变通过抑制和诱导不同基因来介导，所述基因的产物涉及范围从P源的摄取和获得到新细胞组分的从头合成(36，18)。此外，体外研究显示在一些这类细菌中观察到P 溶解活性和生长素吲哚-3-乙酸(IAA)的生成(39，17)，尽管没有证明连接IAA生成和P溶解的直接关联。在不同的微生物中研究P摄取。包括苜蓿根瘤菌(S.meliloti)在内的许多细菌具有至少两种P转运系统，与高和低亲和力转运系统相一致。所述高亲和力系统由Ph0CDET 操纵子编码，而低亲和力系统由pit (在orfA-pit操纵子内)编码。在苜蓿根瘤菌中编码两种P转运系统的基因表达受PhoB激活剂控制。在P过量情况下，PhoB失活，pho⑶E环表达。在P有限的情况下，所述低亲和力Pit通透酶系统受活化的PhoB抑制，而高亲和力 PhoCDET系统被诱导并变为P转运的主要机制(10)。许多菌株含有产物pstSCAB同系物作为高亲和力磷酸盐转运子。在没有磷胁迫时观察到苜蓿根瘤菌1021的pstC ORF中的1碱基缺失很可能负责(通过PhoB) 12个磷饥饿诱导基因的中等组成型激活(24，43)。在植物和微生物中，PR溶解的主要机制是H+分泌、有机酸生成和酸性磷酸酶生物合成(2，3)。包括乙酸、乳酸、苹果酸、草酸、琥珀酸、柠檬酸、葡糖酸、酮葡糖酸等的有机酸可与磷酸铁和磷酸铝中的铁或铝形成复合体，从而将植物可利用的磷酸盐释放到土壤中(18， 22)。有机酸还可通过阻断土壤颗粒的P吸收位置或通过与土壤矿物表面的阳离子形成复合体来提高P利用率(36)。大多数有机磷化合物的矿物化通过磷酸酶进行。土壤中这些酶的主要来源被认为是微生物来源。具体地，磷酸酶活性在根围明显增加。多数土壤的PH值从酸性到中性。因此，酸性磷酸酶在此过程中应起主要作用(36)。在本专利技术中，分析了苜蓿根瘤菌1021株RD64的P溶解能力和其对苜蓿宿主植物生长的影响。本作者使用苜蓿根瘤菌_截形苜蓿(S. meliloti-M. truncatula)系统，因为所述细菌可利用微阵列且苜蓿是用于不确定的根瘤发育的公认模式系统。所述RD64株之前已工程改造为过量生成IAA(11，35)，显示其能在液体生长培养基中释放与野生型1021相比最多78倍的IAA (12，21)。之前也有报道称在用IAA处理的大肠杆菌(E.coli)细胞(7)中发现RD64更加耐盐以及其他非生物胁迫(5)。被该株根瘤化的苜蓿植物具有较高程度的保护免受盐胁迫诱导的氧化损伤(5)。此外，之前证明IAA以尚未了解的机制引发非常远的系统如转化人细胞(15)、大肠杆菌(8)和苜蓿根瘤菌(21)的三羧酸循环或柠檬酸循环、TCA循环中酶的诱导。为了评价苜蓿根瘤菌RD64中IAA过量生成引发的总体效应，用微阵列分析比较了野生型1021和RD64及用IAA和其他四种化学上或功能上相关的分子处理的1021的基因表达图谱。在RD64和IAA处理的1021细胞差异表达的基因中，本作者发现pho操纵子的两个基因。该意外发现引导作者检测RD64中矿物P溶解机制和P饥饿情况下该菌株改善苜蓿生长的潜在能力。P饥饿情况定义为细菌1021或RD64在含有1. OmM磷酸钾的培养基中生长时段。自由生长条件下观察到RD64的酸性磷酸酶活性和有机酸分泌的提高。此外，从被该菌株根瘤化的苜蓿植物根部渗出的有机酸含量高于被1021野生型菌株根瘤化的植物所测。此效应与观察到的这些植物中增加的P溶解和植物干重生成相关联。专利技术描述本专利技术中，用W000/28051 (RD64 株)所述的质粒 pG-Promintron-iaaM-tms2 将苜蓿根瘤菌1021株工程改造为过量生产植物激素IAA。本领域技术人员应理解也可工程改造其他株系。本专利技术意外发现RD64可高效地从不可溶来源如磷酸盐岩(PR)中活化P。在P有限条件下，RD64相较1021野生型菌株更高的P活化性与所述高亲和力P转运系统的编码基因上调、酸性磷酸酶活性的诱导和分泌到生长培养基中的马来酸、琥珀酸以及富马酸的增加相关联。P有限条件在仅细菌生长于确定的最小培养基时涉及5%的PR浓度，或在1021 或RD64根瘤化的苜蓿植物生长于确定的最小培养基时涉及0. 02%的PR浓度。在P有限条件下生长时，与所述野生型菌株(Mt-1021)根瘤化的植物相比，RD64(Mt-RD64)根瘤化的截形苜蓿(Medicago truncatula)植物释放较高含量的另一种P溶解有机酸，2_羟戊二酸。已证明与Mt-1021植物相比，Mt-RD64植物显示出较高的干重生成。本作者在此报道了与P有限的Mt-1021植物相比，P有限的Mt-RD64植物的芽和根鲜重也表现出显著增长。本作者讨论了在根瘤菌属-豆科(rhizobium-legume)模式系统中，与细菌IAA过量生产而不是IAA生产相连的不同因子的平衡相互作用本身是如何在胁迫环境条件下(具体是在P有限情况下)刺激植物生长。因此，能够为植物生长提供溶解P的土壤细菌如RD64，对改善农业产量特别有利，特别是在热带地区如化学肥料使用有限且有大量可利用I3R资源的撒哈拉沙漠以南 (sub-Saharan) jftlK。因此本专利技术的一个目的是将具有高吲哚-3-乙酸(IAA)含量的细菌用于溶解土地中的磷酸盐岩，其中所述细菌通过转化能够增加IAA含量的试剂的编码基因而获得。 能够增加IAA含量的所述试剂优选为吲哚乙酰胺水解酶(iaaM)或色氨酸一氧化物酶(tms2)。 在一个优选的实施方式中，所述细菌属于根瘤菌属。所述根瘤菌属的细菌优选苜蓿根瘤菌种。所述细菌还优选能生成吲哚-3-乙酸(IAA)植物激素。所述细菌还优选包含在豆科植物根瘤中。本专利技术的另一个目的是为可根瘤化的植物和/或所述植物生长周边土壤提供可溶性磷的方法，其包括用具有高吲哚-3-乙酸(IAA)含量的细菌诱导所述植物根瘤化，其中所述细菌通过转化能增加IAA含量的试剂的编码基因而获得。能够增加IAA含量的所述试剂优选为吲哚乙酰胺水解酶(iaaM)或色氨酸一氧化物酶(tms2)。所述细菌优选属于根瘤菌属。本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：R·德费，
申请(专利权)人：国家研究院，
类型：发明
国别省市：
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