一种动物固体排泄物中克伦特罗的测定方法技术

本发明专利技术公开了一种动物固体排泄物中克伦特罗的测定方法，通过对待测样品前处理改进并且和检测条件的改进，采用高效液相色谱串联质谱法进行测定，无需酶解过夜，该前处理方便快捷，回收率稳定，可准确测定动物排泄物中的克伦特罗含量，并且该方法操作时间短、重复性好、灵敏度高。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及检测
，具体涉及动物固体排泄物中克伦特罗的测定方法。
技术介绍
克伦特罗是一种β-肾上腺素能受体激动剂类化合物(以下简称：β-受体激动剂)，在人医临床上常被用作平喘药物，用于调节支气管扩张和平滑肌松弛，治疗呼吸系统疾病。由于对动物具有一定的促进生长、提高瘦肉率的作用，而被称之为“瘦肉精”。农业部176号和1519号公告明确规定的禁止在养殖动物上使用克伦特罗，但仍有不法分子受利益驱使非法使用克伦特罗，国内外屡屡发生以克伦特罗为代表的“瘦肉精”中毒事件。为保障人民群众身体健康，对“瘦肉精”类药物非法使用的监管非常重要。现有的养殖家畜尿样中中克伦特罗的提取、净化方法主要参照中华人民共和国农业部行业标准(农业部1063号-3-2008文件)执行，现行农业部标准及各地地方标准中暂时只有动物尿液中β-受体激动剂的检测标准，没有动物固体排泄物中相关物质的测定方法。并且对于样品的前处理方法主要以固相萃取、液液萃取为主，处理相对来说比较复杂，有机溶液残留量较高。
技术实现思路
为解决现有技术中缺陷，本专利技术提供一种动物固体排泄物中克伦特罗的测定方法，该方法操作时间短、重复性好、灵敏度高。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种动物固体排泄物中克伦特罗的测定方法，所述测定方法包括如下步骤：(1)首先对待测样品进行前处理，具体处理过程如下：A.配制不同浓度的标准品溶液：首先制备标准储备液，准确称取适量克伦特罗标准品，用甲醇配制成浓度为100μg/L的标准储备液，保存于18℃冰箱中；其次同位素内标储备溶液制备，内标物克伦特罗-D5用甲醇配制成浓度为100μg/L的标准储备液，保存于18℃冰箱中；然后将标准储备液用甲醇配制成浓度分别为0.5ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL的标准品溶液备用；B.提取称取3g精确至0.01g的待测样品置于50mL离心管中，加入100ng/mL克伦特罗内标溶液150μL，在加标回收样品中另加入100ng/mL克伦特罗标准溶液75μL，再加入1％醋酸乙腈溶液15mL，涡旋混匀5min，超声提取15min，再涡旋混匀5min后在转速为4000r/min离心机中离心5min；C.净化将离心后得到的上清液全部转移到准备好的净化管(净化管中加入马弗炉烘过干燥的无水硫酸钠、C18、PSA)中，涡旋混匀5min，在转速为4000r/min离心机中离心5min，用移液枪准确吸取5mL上清液移入10mL离心管中，然后将离心管放入40℃水浴中氮气吹干；D.复溶向吹干的离心管中加入0.5mL定溶液，超声处理30s后再涡旋混匀5min，过0.22μm复合滤膜，于进样小瓶中准备上机；所述定溶液为含0.1％甲酸的10％甲醇水溶液；其中含0.1％甲酸的10％甲醇水溶液均为体积比，具体为取1mL甲酸，100mL甲醇然后用水定容到1000mL即可。(2)然后采用高效液相色谱串联质谱法对待测样品定性和定量检测：A、取5.0μL待测样品溶液进样，用高效液相色谱-质谱联用仪分析检测，得到待测样品溶液中克伦特罗和克伦特罗内标的定量离子色谱峰面积；B、将步骤(1)配制的不同浓度的克伦特罗标准品溶液，用高效液相色谱-质谱联用仪分析检测，检测条件与待测样品溶液相同，获得标准品溶液中克伦特罗和克伦特罗内标的定量离子色谱峰面积；C、以克伦特罗和克伦特罗内标的定量离子峰面积之比为纵坐标，以标准品溶液中克伦特罗浓度为横坐标制作样液中克伦特罗浓度标准曲线；D、根据待测样品提取液中克伦特罗和克伦特罗内标的定量离子峰面积，结合标准曲线，计算得到待测样品提取液中克伦特罗的浓度C，以此进行定量测定，以定性离子色谱峰面积与定量离子色谱峰面积比值(相对离子丰度)在30-70％之间，进行定性确认；其中待测样品提取液中克伦特罗的浓度C的计算公式为：其中：C为待测样品提取液中克伦特罗的含量，单位为ng/mL；c为标准溶液中克伦特罗的浓度，单位为ng/mL；csi为标准溶液中克伦特罗内标的浓度，单位为ng/mL；ci待测样品提取液中克伦特罗内标的浓度，单位为ng/mL；A为待测样品提取液中克伦特罗定量离子的色谱峰面积；As为标准中克伦特罗定量离子的色谱峰面积；Asi为标准中克伦特罗内标的定量离子的色谱峰面积；Ai为待测样品提取液中克伦特罗内标的定量离子的色谱峰面积；其中所述高效液相色谱-质谱联用仪分析检测的具体条件如下：B.进样条件：采用C18色谱柱(所述C18色谱柱采用安捷伦ZORBAX快速分辨率高清色谱柱；规格为内径3.0mm，柱长100mm，粒度1.8μm)，以乙腈为流动相A，以含0.1％甲酸的5mM乙酸铵水溶液为流动相B，梯度洗脱，流速为0.4mL/min，柱温为30℃，结束时间为10min，进样量为5μL；B.质谱/质谱条件：离子化模式：电喷雾电离正离子模式扫描方式：多反应监测(MRM)喷射电压：4000V△-电磁碰撞：200V雾化器压力：40psi干燥气流量：10L/min干燥气温度：325℃。优选地，C18色谱柱采用安捷伦ZORBAX快速分辨率高清色谱柱；规格为内径3.0mm，柱长100mm，粒度1.8μm。优选地，流动相A：乙腈，流动相B：0.1％甲酸的5mM乙酸铵水溶液。优选地，所述梯度洗脱的具体条件为(见表1)：表1梯度洗脱的具体条件优选地，定量离子对为277.2/203.1，定性离子对为277.2/259.1。其中，上述待测样品为克伦特罗的判定方法为：待测样品和克伦特罗标准品保留时间相同，在相同的定量离子对为277.2/203.1，定性离子对为277.2/259.1条件下，两者的定量离子对和定性离子对相对丰度比值在30％-70％之间，判定为待测样品为克伦特罗。本专利技术的有益效果为：本方法无需酶解过夜，前处理方便快捷，回收率稳定，可准确测定动物排泄物中的克伦特罗含量。附图说明图1为标准品溶液中克伦特罗和克伦特罗内标的总离子流图；图2是标准品溶液中克伦特罗和克伦特罗内标的定量离子色谱峰图；图3是待测样品溶液中克伦特罗和克伦特罗内标的定量离子色谱峰图；图4是标准品溶液中克伦特罗标准曲线；图5是标准品克伦特罗定性离子色谱图(含相对离子丰度)。具体实施方式下面将参照附图更详细地描述本专利技术的具体实施例。虽然附图中显示了本专利技术的具体实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本专利技术而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本专利技术，并且能够将本专利技术的范围完整的传达给本领域的技术人员。如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”或“包括”为一开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。说明书后续描述为实施本专利技术的较佳实施方式，然所述描述乃以说明书的一般原则为目的，并非用以限定本专利技术的范围。本专利技术的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。一、所选用的试剂1、克伦特罗标准溶液2、克伦特罗内标溶液3、1％醋酸乙腈溶液4、0.1％甲酸的10％甲醇水5、乙腈6、乙酸铵7、0.1％甲酸二、所使用的仪器1、离心管，2、超声振荡器，3、离心机：SIGMA3K15，4、净化管，5、移液枪、6、水浴池，7、安捷伦ZORBAX快速分辨率高清色谱柱、8、高效液相色谱本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种动物固体排泄物中克伦特罗的测定方法，其特征在于，所述测定方法包括如下步骤：(1)首先对待测样品进行前处理，具体处理过程如下：A.配制不同浓度的标准品溶液：制备标准储备液：准确称取克伦特罗标准品，用甲醇配制成浓度为100μg/L的标准储备液，保存于18℃冰箱中；制备同位素内标储备溶液：内标物克伦特罗‑D5用甲醇配制成浓度为100μg/L的标准储备液，保存于18℃冰箱中；然后将标准储备液用甲醇配制成浓度分别为0.5ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL的标准品溶液备用；B.提取称取3g精确至0.01g的待测样品置于50mL离心管中，加入100ng/mL克伦特罗内标溶液150μL，在加标回收样品中另加入100ng/mL克伦特罗标准溶液75μL，再加入1％醋酸乙腈溶液15mL，涡旋混匀5min，超声提取15min，再涡旋混匀5min后在转速为4000r/min离心机中离心5min；C.净化将离心后得到的上清液全部转移到准备好的净化管中，涡旋混匀5min，在转速为4000r/min离心机中离心5min，用移液枪准确吸取5mL上清液移入10mL离心管中，然后将离心管放入40℃水浴中氮气吹干；D.复溶向吹干的离心管中加入0.5mL定溶液，超声处理30s后再涡旋混匀5min，过0.22μm复合滤膜，于进样小瓶中准备上机；所述定溶液为含0.1％甲酸的10％甲醇水溶液；(2)然后采用高效液相色谱串联质谱法对待测样品进行定性和定量检测：A、将配制的不同浓度的克伦特罗标准品溶液，用高效液相色谱‑质谱联用仪分析检测，检测条件与待测样品溶液相同，获得标准品溶液中克伦特罗和克伦特罗内标的定量离子色谱峰面积；B、取5.0μL待测样品溶液进样，用高效液相色谱‑质谱联用仪分析检测，得到待测样品溶液中克伦特罗和克伦特罗内标的定量离子色谱峰面积；C、以克伦特罗和克伦特罗内标的定量离子峰面积之比为纵坐标，以标准品溶液中克伦特罗浓度为横坐标制作样液中克伦特罗浓度标准曲线；D、根据待测样品提取液中克伦特罗和克伦特罗内标的定量离子峰面积，结合标准曲线，计算得到待测样品提取液中克伦特罗的浓度C，以此进行定量测定，以定性离子色谱峰面积与定量离子色谱峰面积比值在30～70％之间，进行定性确认；所述待测样品提取液中克伦特罗的浓度C的计算公式为：C=c×ci×A×Asicsi×Ai×As]]>其中C为待测样品提取液中克伦特罗的含量，单位为ng/mL；c为标准溶液中克伦特罗的浓度，单位为ng/mL；csi为标准溶液中克伦特罗内标的浓度，单位为ng/mL；ci待测样品提取液中克伦特罗内标的浓度，单位为ng/mL；A为待测样品提取液中克伦特罗定量离子的色谱峰面积；As为标准中克伦特罗定量离子的色谱峰面积；Asi为标准中克伦特罗内标的定量离子的色谱峰面积；Ai为待测样品提取液中克伦特罗内标的定量离子的色谱峰面积。...

【技术特征摘要】
1.一种动物固体排泄物中克伦特罗的测定方法，其特征在于，所述测定方法包括如下步骤：(1)首先对待测样品进行前处理，具体处理过程如下：A.配制不同浓度的标准品溶液：制备标准储备液：准确称取克伦特罗标准品，用甲醇配制成浓度为100μg/L的标准储备液，保存于18℃冰箱中；制备同位素内标储备溶液：内标物克伦特罗-D5用甲醇配制成浓度为100μg/L的标准储备液，保存于18℃冰箱中；然后将标准储备液用甲醇配制成浓度分别为0.5ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL的标准品溶液备用；B.提取称取3g精确至0.01g的待测样品置于50mL离心管中，加入100ng/mL克伦特罗内标溶液150μL，在加标回收样品中另加入100ng/mL克伦特罗标准溶液75μL，再加入1％醋酸乙腈溶液15mL，涡旋混匀5min，超声提取15min，再涡旋混匀5min后在转速为4000r/min离心机中离心5min；C.净化将离心后得到的上清液全部转移到准备好的净化管中，涡旋混匀5min，在转速为4000r/min离心机中离心5min，用移液枪准确吸取5mL上清液移入10mL离心管中，然后将离心管放入40℃水浴中氮气吹干；D.复溶向吹干的离心管中加入0.5mL定溶液，超声处理30s后再涡旋混匀5min，过0.22μm复合滤膜，于进样小瓶中准备上机；所述定溶液为含0.1％甲酸的10％甲醇水溶液；(2)然后采用高效液相色谱串联质谱法对待测样品进行定性和定量检测：A、将配制的不同浓度的克伦特罗标准品溶液，用高效液相色谱-质谱联用仪分析检测，检测条件与待测样品溶液相同，获得标准品溶液中克伦特罗和克伦特罗内标的定量离子色谱峰面积；B、取5.0μL待测样品溶液进样，用高效液相色谱-质谱联用仪分析检测，得到待测样品溶液中克伦特罗和克伦特罗内标的定量离子色谱峰面积；C、以克伦特罗和克伦特罗内标的定量离子峰面积之比为纵坐标，以标准品溶液中克伦特罗浓度为横坐标制作样液中克伦特罗浓度标准曲线；D、根据待测样品提取液中克伦特罗和克伦特罗内标的定量离子峰面积，结合标准曲线，计算得到待测样品提取液中克伦特罗的浓度C，以此进行定量测定，以定性离子色谱峰面积与定量离子色谱...

【专利技术属性】
技术研发人员：代玲玲，贾建军，张花利，周秀芝，
申请(专利权)人：山东拜尔检测有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37