用于多重分析物检测和定量的方法技术

本申请涉及一种采用单一反应器，对测试样品中的多重目标分析物进行检测和定量的方法。该方法采用反应器(多孔板)，其包括微阵列：(a)校准点，各点具有预定量的目标分析物；以及(b)捕捉点，各点具有有选择性结合目标分析物的试剂(抗体)。捕获的分析物和校准点用针对每个不同目标分析物的特异性荧光标记抗体检测。校准点用于生成使得能对不同目标分析物浓度进行测定的校准曲线。本申请还涉及一种对用于诊断类风湿关节炎的生物标记物进行检测和定量的方法。更具体地，本申请公开了类风湿因子(RF)和环瓜氨酸肽(CCP)作为捕获点的应用。最后，基于上述方法，本发明专利技术提出了一种诊断或监测类风湿关节炎的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及用于定量分析物的方法，特别是本专利技术涉及用于检测和定量单一样品中多重分析物的改进的微阵列方法。
技术介绍
目前的免疫检测方法，由于它们在单反应孔中的每次检测循环仅能检测一种目标物，因此受到局限。与任何病理或生理疾病的检测和诊断有关的几种抗原物质或生物标记物是常见的。为证实多个标记物的存在，测试样品中的每个标记物需要单独的和不同的免疫检测，以证实每个待测靶分子的存在。这种测试和样品的多种需要增加时间延迟治疗，增加了成本和分析误差的可能性。目前的现有技术，多重蛋白/抗体特别是在自身免疫疾病中表达的生物标记物的定量领域，依赖于测定多重抗原。酶联免疫吸附试验(ELISA)是由Engvall等人研发的，Immunochem.，8 871 (1971)，并进一步由 Ljunggren 等人，J. Immunol. Meth. ,88 :104(1987)和 Kemeny 等人， Immunol. Today 7:67(1986)改善。ELISA及其应用是本领域众所周知的。单一 ELISA的功能是用酶标记的抗体和显色底物检测单一分析物或抗体。为检测样品中一种以上的分析物，需要进行单独的ELISA以独立地检测每一种分析物。例如，为检测两种分析物，需要两个单独的ELISA板或两套孔，即每种分析物用一个板或一套孔。现有技术中基于ELISA的显色反应一次仅检测一种分析物。这在检测具有一种以上标记物的疾病或表达一种以上转基因产物的转基因有机体时是一个主要的限制。Macri, J. N.等人，Ann Clin Biochem 29 :390-396(1992)中描述了一种间接检测， 其中抗体(试剂-1)首先与分析物反应，然后第二标记抗-抗体(试剂- 与试剂1的抗体反应。结果是需要两个单独的洗涤步骤，违背了直接检测的目的。US2007141656,Mapes等人，通过比较包被有自身抗原特异性单克隆抗体的磁珠和包被有自身抗原的磁珠，来测定自身抗原和自身抗体的比例。该方法允许至少一种分析物与相应的反应物反应，即一种分析物是自身抗原，所述反应物是自身抗原的自身抗体。用于检测多种分析物的另一方法公开于US2005118574，Chandler等人，其是利用流式细胞仪测量进行分类，实时、同步和自动检测并分析多种生物分子或DNA序列，同时也降低了成本。WO 0113120，Chandler和Chandler测定了单一样品中几种不同分析物的浓度。仅当使用流式细胞仪分析每个样品/分析物组合具有独特的微粒亚群时，这是必要的。这些以磁珠为基础的系统的能力仅限于同时检测到的捕获抗原之间的鉴别。一种以上分析物的同时检测，即同时测定蛋白的多重检测已被Haab等人描 ^E, "Protein micro-arrays for highly parallel detection and quantization of specific proteins and antibodies in complex solutions，，，Genome Biology 2(2) 0004. 1-0004. 13，(2001)，其以参阅的方式并入于此。制备不同的抗体和抗原混合物并用红色荧光染料标记，然后与含有相同抗体和抗原的绿色荧光参照混合物混合。观察到的红色与绿色之间比率的差异用来反映在混合物中相应的结合部分的浓度差异。Mezzasoma 等人(Clinical Chemistry 48，1，121-13(^2002)发表了微阵列形式 (microarray format)方法以检测在两个单独的测试中与相同捕获物结合的分析物，特别是与相同抗原反应的不同的自身抗体。该结果揭示了当捕获的分析物与一种报告分子(例如检测免疫球蛋白IgG)孵育时，检测相应的分析物。在测试中，当捕获的分析物与第二报告分子使用独立的微阵列固态基板(例如检测IgM)孵育时，检测第二分析物(IgM)。W00250537,Damaj和Al_assaad公开了一种检测与以混合物形式首先包被于固体基板(substrate)上的必需抗体结合的多达三种固定化伴随靶抗原的方法。检测第一标记物之前，进行洗涤步骤。通过加入第一特异性底物，可检测到第一标记物的存在。读取反应孔并用光镜检测颜色变化。检测第二标记物之前，进行另一次洗涤步骤。通过向反应孔中加入对第二种酶特异的第二底物，可检测到第二标记物的存在。充分孵育后，可检测反应孔的颜色变化。同样，检测第三标记物之前，可进行洗涤步骤。通过向反应孔中加入对第三种酶特异的第三底物，可检测到第三标记物的存在。 充分孵育后，可检测反应孔的颜色变化。虽然可在一个反应或测试孔中检测到多个分析物， 但每个反应是分别进行的。W02005017485, Geister等人描述了在单一测试中连续测定至少两种不同抗原的方法，其通过至少两种酶标记的共轭物与两种不同的用于测定所述酶(ELISA)的显色底物发生两个不同的酶反应，其包括(a)提供固定于固体支持物上的对第一分析物特异的第一抗体和对第二分析物特异的第二抗体；(b)使固定于固体支持物上的抗体与可能含有一种或两种抗原的液体样品接触足够的时间，以使抗体和抗原结合；(c)从液体样品中去掉固体支持物并洗涤该固体支持物，以去除未结合的物质；(d)使固体支持物与含有对第一抗原特异的第三抗体和对第二抗原特异的第四抗体的溶液接触足够的时间，以使第三和第四抗体与带有第一和第二抗体的分析物结合，其中，第三抗体与第一酶标物共轭结合，第四抗体与第二酶标物共轭结合；(e)从溶液中去掉固体支持物并洗涤该固体支持物，以去除未结合的抗体；(f)加入用于第一酶标物的第一显色底物，其中通过第一酶标物使第一显色底物转化为可检测的颜色，表示该样品中含有第一分析物；(g)去除第一显色底物；以及 (h)加入用于第二酶标物的第二显色底物，其中通过第二酶标物使第二显色底物转化为可检测的颜色，表示该样品中含有第二分析物。美国专利7，022，479，2006，^^81^1~，名称为“561181衍￥6，111111^ 16叉6(1 diagnostic assays for protein analysis”公开了一种检测样品中多个不同化合物的方法，该方法包括(a)使样品与结合试剂的混合物接触，结合试剂为核酸蛋白融合物，各含有(i)蛋白部分，已知其可与一种化合物特异性结合；以及(ii)核酸部分，其含有独特的鉴别标签，且在一个实施方案中，其编码所述蛋白；(b)使所述结合试剂的蛋白部分和该化合物形成复合物；(c)捕获该结合试剂-化合物的复合物；(d)扩增结合有试剂的所述复合物的核酸部分独特的鉴别标签；以及(e)检测各扩增核酸的独特的鉴别标签，从而检测样品中相应的化合物。尽管已知多种用于检测和定量分析物的方法，但这些方法需要针对每个目标分析物采用单独的检测步骤，这样可能会非常耗时和昂贵，特别是在临床上。专利技术概述本专利技术提供了一种使用单一反应器，检测和定量测试样品中多目标分析物的快速和成本效率高的方法。本文公开的方法允许多目标分析物的同时检测，而无需进行每个目标分析物的单独检测或反应步骤。一方面，本专利技术提供用于检测和定量测试样品中两个或更多目标分析物的方法， 包括a)提供印本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：彼得·李，
申请(专利权)人：SQI诊断系统有限责任公司，
类型：发明
国别省市：