结合内外校准法的分析物定量多重微阵列制造技术

本发明专利技术涉及用于分析物量化的多重微阵列和方法。尤其是，本发明专利技术涉及改进的方法，该方法根据参考标准曲线对测试样本中目标分析物浓度进行标准化，该参考标准曲线是从已知浓度目标分析物的经验证、核准和公认的参考标准中导出的。本发明专利技术还涉及用于对确定正常化标准和控制的置信度进行同时测量的方法和检查。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及用于分析物定量的多重微阵列和方法，尤其是，本专利技术涉及改进的方法，该方法针对内部参考标准化曲线和从已知参考标准获得的标准化曲线来对分析物浓度进行标准化。本专利技术还涉及对用于确定正常化标准和控制的置信度进行同时测量的方法和校验。
技术介绍
生物标记是可被测量和评价的特性，作为有机体的生物状态的指示剂。在医学中，生物标记可以是外生的物质，其被引入到患者体内以检查生物过程，比如器官功能及生物化学机能和路径。生物标记也可以是从患者处获得的生物分子，比如蛋白质或核酸，其表示具体的疾病状态或者对药物治疗的反应。这样的生物化学生物标记在新药的发现和研发中也是特别有用的。在这些药物的早期临床研究期间，合适的生物标记的量化可以潜在地帮助研究人员更快速地识别最有希望的候选药物，因此精简了药物开发过程。与疾病有关的生物标记还可用于疾病的诊断和预后，并用作对疗效的测定。因此，这对于识别和验证新的生物标记(其可以用于评估患者的健康和/或对治疗介入的响应)以及提供用于已知生物标记的准确且可复制的确定的方法是非常重要的。生物标记分析高度地依赖于诸如抗体的试剂的完整性，该试剂本身是从生物源得到的并因此可能受到质量控制和稳定性因素的影响。在许多生物标记分析过程中使用了未核准的标准，比如重组蛋白质和替代矩阵，从而导出校准曲线。因此，需要进行平行研究，其中对替代矩阵中组成的一定范围的校准标准浓度的分析的响应是与对一系列患者样本稀释液的分析的响应相当的。稀释线性度也可能存在问题，因为抗体和配体结合的亲和力可以在不同的介质中有很大变化。生物标记分析的开发和鉴定的目的是为了开发用于临床获益的分析。基于目标抗原的抗体的结合特异性，诸如酶联免疫吸附测定(“ELISA”)的免疫分析在本领域中是众所周知的(参见例如，Engvall等人，免疫化学，1971年，8卷，第871页；Ljunggren等人,免疫方法杂志，1987年,88卷，第104页；Kemeny等人,当代免疫学，1986年，7卷，第67页)。免疫分析对于识别新的生物化学生物标记，比如蛋白质或核酸，以及量化已知的生物标记是非常有用的，因为可针对特定的生物标记而产生抗体。通过免疫分析定量确定生物标记的方法的实例在本领域中是已知的。参见例如，Hawkes等人，生物化学分析，1982年，119卷，第142-147页，和Tobin和Gordon，免疫方法杂志，1984年，72卷，第313-340页，和Gordon等人的序号为5，486，452、名称为“用于免疫分析的装置和工具”的美国专利。以前所采用的免疫分析方法易于受到限制，因为其在每个测试周期中只能在单个反应容器内检测一个目标分析物。已经通过将探针分子(例如抗体)附着至固体基底(例如盘上的珠子或孔)、然后将测试样本、缓冲液和试剂溶液布满固体基底进行了尝试，以减少完成每个测试周期的时间，并增加在每个周期中所完成的测试的量。微阵列是一种装置，其中大量(例如数百至数千)的比如DNA和蛋白质的生物分子的样本被附着或固定于适合的未反应基底表面，比如塑料(例如聚丙烯、聚苯乙烯、环烯)、硅树脂和玻璃。如果基底表面相对平直，生物分子可以被“印刷”到表面上，由此通过应用含有已知浓度生物分子的已知体积的“测定点位”的缓冲液来实施印刷。使用固定于已知基底或基底表面上的已知位置的生物分子，基底表面可以被暴露于生物化学/化学试剂，以用于检测、定性和定量分析的目的。例如，微阵列可以用于实施ELISA型免疫分析，其中固定于基底的生物分子为抗体，然后基底表面被暴露于含有抗原(其上可结合抗体)的测试溶液。然后可用缓冲溶液布满基底表面并使其暴露于第二抗体，该第二抗体要么与可检测标签(例如放射性标签或荧光染料)配对，要么与酶(该酶对反应进行催化，对该反应的反应产物进行染色且因此可被检测到)配对。因此微阵列容许大量样本的高通量分析。同时，已经开发了计算机软件程序来分析从微阵列中产生的大量数据。 微阵列的大量实例和对由微阵列所提供的数据进行处理的方法在本领域中是已知的。参见例如Ghandour等人的序号为6，516，276、名称为“用于对来自生物分子阵列的数据进行分析的方法和设备”的美国专利，Shah的序号为6，916，621、名称为“用于基于阵列的比较结合测定的方法”的美国专利，和Minor的序号为7，072，806、名称为“用于横跨多个平台进行数据值比较的方法和系统”的美国专利。典型地，若干抗原物质或生物标记是与包括疾病的生物过程的检测和诊断相关联的。为了确定多个生物标记的存在，将需要对测试样本中的每个标记实施单独的免疫分析。这大大增加了分析给定测试样本的时间量，并产生了其它的问题，比如随着必须实施每一项分析而增加的增大的成本和增大的实验误差。因此，希望识别和采用生物标记的定量确定方法，其容许对多个抗原或生物标记同时进行检测和定量测量，即“多重”检测和确定。由于微阵列容许同时、多重的生物化学分析，微阵列可适用于执行多重分析物的检测。为了增加现有微阵列的容量，已开发了“多重”微阵列，其中多个不同的探针生物分子存在于同一个微阵列中。这容许用户检测和分析测试样本中多于一个的目标分析物。这对于多个生物标记的组织液/体液样本的高通量筛选尤其有用，其可以用于检测和诊断包括病原和生理功能紊乱的生物过程。在使用微阵列时可产生大量的问题，包括难于获得准确定量化分析和重现性。在试图进行多重检测时，这类问题将更显著。在已被固定至微阵列表面的生物分子之间可产生交叉杂交。另外，在印刷过程中，并不是所有期望量的生物分子都可以附着至基底表面。例如，在较平直的基底表面的情况下，在基底表面上可以存在生物分子量的不均匀印刷，其会影响量化分析的准确性。而且，在分析过程中，在应用和移除分析试剂时，未知量的生物分子可以被冲掉。因此，在分析过程中基底表面上给定位置内的生物分子的实际量可能小于理论印刷量，即基于测试点位缓冲液的已知浓度和应用于表面的测试点位缓冲液的体积所计算得到的量。然而，现有技术中对测试样本内的分析物量进行量化的方法不考虑固定在微阵列上的生物分子的理论量和实际量之间的差异。因此，需要开发一种对微阵列中获得的数据进行标准化的方法，以使微阵列方法中固有的实验误差最小化，比如，这种误差可能是由于基于涂层/测试点位缓冲液浓度的微阵列基底表面上的生物分子的理论浓度和存在于基底表面上的生物分子的实际浓度之间的差异。另外，由于多重微阵列的单个测试周期可提供来自多个分析或多批标准的数据，需要比较多个分析或多批标准的方法，使得不同分析或标准之间的转换值成为可能，并提供覆盖所有这些分析的参考基础。
技术实现思路
根据本专利技术的广阔方面，提供了一种用于对测试样本中一个或多个分析物进行量化的方法，其包括(a)提供多个离散反应基底，每个反应容器具有印制在其上的微阵列，所述微阵列包括含有多个校准点的校准矩阵，每个校准点含有预定量的校准化合物，其中每个校准点对应于所述校准化合物的理论浓度；和分析物捕捉矩阵，其包含多个捕捉点，每个捕捉点含有预定量的试剂，所述试剂可选择地结合至所述分析物；(b)将预定体积的测试样本应用于所述离散反应基底中的一个；(C)提供多个参考标准，每个参考标准具有已知浓度且每个参考标准含有预定量的每个所述分析本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2009.10.30 CA 2,684,6361.一种用于量化测试样本中的一个或多个分析物的方法，其包括 (a)提供多个离散反应基底，每个反应容器具有印制在其上的微阵列，所述微阵列包括 含有多个校准点的校准矩阵，每个校准点含有预定量的校准化合物，其中每个校准点对应于所述校准化合物的理论浓度；和 分析物捕捉矩阵，其包含多个捕捉点，每个捕捉点含有预定量的试剂，所述试剂可选择地结合至所述分析物； (b)将预定体积的测试样本应用于所述离散反应基底中的一个； (C)提供多个参考标准，每个参考标准具有已知浓度且每个参考标准含有预定量的每个所述分析物； Cd)将预定体积的每个参考标准应用于所述离散反应基底中的一个； (e)在来自步骤(b)和步骤(d)的每个离散反应基底上 (i)应用被标记的报告化合物，其中所述被标记的报告化合物提供可测量的信号强度，所述信号强度与结合至每个点的分析物或者校准化合物的量成正比； (ii)测量所述微阵列内的每个点的信号强度值； (iii)对步骤(b)中的反应基底生成第一校准曲线，并对步骤(d)中的反应基底生成第二校准曲线，在每种情况下，所述校准曲线是通过将曲线与图表进行拟合而制备的，所述图表将信号强度值与校准化合物理论浓度进行对比； (iv)使用所述第一校准曲线，确定所述测试样本的第一分析物当量浓度，并且使用所述第二校准曲线，确定每个所述参考标准的第二分析物当量浓度； (f)通过将曲线与图表进行拟合来生成参考标准化曲线，所述图表将所述第二分析物当量浓度与每个参考标准的已知浓度进行对比；和 (g)使用所述参考标准化曲线，对所述测试样本的第一分析物当量浓度进行标准化，以获得修正后的分析物浓度。2.如权利要求I所述的方法，其中，在步骤(e(iii))中，所述第一和第二校准曲线通过以下生成 (1)在所述校准矩阵中，如果所述校准矩阵含有两个或多个校准点，且所述校准点为对应于所述校准化合物的常用理论浓度的复制点，则将每个复制校准点的信号强度值标准化为每个所述校准点的平均信号强度值；和 (2)将曲线与图表进行拟合，所述图表将每个所述校准点的平均信号强度值与每个对应校准标准的对应的理论浓度进行对比。3.如权利要求I或2所述的方法，其中，在步骤(e(iv))中，所述测试样本或者所述参考标准中的分析物的浓度是由以下确定的 (3)在步骤(b)和步骤(d)中的每个反应基底的所述分析物捕捉矩阵中，如果所述分析物捕捉矩阵含有两个或多个作为复制的捕捉点，则将每个复制的捕捉点的所述信号强度值标准化为平均信号强度值，并且将每个所述点的信号强度值标准化为每个所述捕捉点的平均信号强度值；和 (4)(i)使用步骤(b)中的反应基底的每个所述捕捉点的平均信号强度值和所述第一校准曲线，计算所述测试样本中的所述分析物的浓度；和(i i)使用步骤(d)中的所述反应基底的每个所述捕捉点的平均信号强度值和所述第二校准曲线，计算每个所述参考标准中的所述分析物的浓度。4.如权利要求2或3所述的方法,其中,通过采用TukeyBiweight算法来实施对校准矩阵和所述样本捕捉矩阵的每个所述点的测量信号强度值的标准化。5.如权利要求I至4中任一项所述的方法，其中，所述分析物捕捉矩阵的点的总数至少等于所述校准矩阵的点的总数。6.如权利要求5所述的方法，其中，存在3至20个之间的对应于线性稀释系列的分析物的不同理论浓度，且其中对于所述校准标准的每个理论浓度存在3至15个之间的点。7.如权利要求I至6中任一项所述的方法，其中，所述被标记报告化合物为荧光标记的抗体。8.如权利要求I至7中任一项所述的方法，其中，所述多个反应基底采取多孔化验板的形式。9.如权利要求I至7中任一项所述的方法，其中，所述多个反应基底采取多个珠子的形式。10.如权利要求I至9中任一项所述的方法，其中，所述测试样本为生物样本。11.一种如权利要求10所述的方法的应用，其中，所述生物样本是从患者处获得的，所述应用包含以下任一种 Ca)监测所述患者疾病的进展； ...

【专利技术属性】
技术研发人员：彼得·李，珍妮弗·汉森，凯特·史密斯，
申请(专利权)人：SQI诊断系统有限责任公司，
类型：发明
国别省市：