本发明专利技术涉及一种用依赖于链置换扩增技术的单核细胞增生李斯特氏菌恒温扩增快速检测试剂盒及其检测方法。该试剂盒内有模板预处理反应液、链置换扩增反应液Ⅰ、Bst?DNA?Polymerase，BsoBI。检测单核细胞增生李斯特氏菌的方法包括细菌DNA的提取、模板预处理、SDA链置换恒温扩增、核酸检测。其优点是快速、特异性强、灵敏度高而且成本低。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属生物检测领域，具体涉及恒温扩增快速检测单核细胞增生李斯特氏菌的试剂盒及检测方法。
技术介绍
单核细胞增生李斯特氏菌(Listeie monocytogenes简称L. M ；单增李氏菌)是一种人畜共患病病原菌，使人和动物患脑膜炎、脑炎、败血症及造成怀孕妇女流产、死胎等疾病。近年来国外报道该菌所致的食物中毒越来越多，病死率高达30% 70%。国内也不断有散发病例，引起了国内医学界的普遍关注。WHO在20世纪90年代已将其列为食品四大致病菌之一。该菌在自然界分布广泛，以家畜、家禽兽为主要宿主，很容易污染食品而引起食物中毒和李斯特病暴发。食品是导致人类受单核细胞增生李斯特氏菌感染的主要传播途径，该菌在4°C冰箱保存的食物中仍可生长繁殖，是冷藏食品威胁人类健康的主要病原菌。 在绝大多数食品中都能找到李斯特氏菌，肉类、蛋类、禽类、海产品、乳制品、蔬菜等都已被证实是李斯特氏菌的感染源。随着我国冷藏、速冻食品消费量的迅速增多，食品中单增李斯特氏菌的潜在危险性也越来越突出，因此在食品卫生微生物检验中，必须加以重视。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种单核细胞增生李斯特氏菌的恒温扩增快速检测试剂盒及其使用方法。本专利技术的另一目的是提供一种单核细胞增生李斯特氏菌的快速检测方法，以克服现有技术的不足，从而为食品安全提供科学的依据和指导作用。本专利技术提供的单核细胞增生李斯特氏菌的恒温扩增快速检测试剂盒，包括(1)模板预处理反应液IXNEB buffer 2，1. 0 μ M上游内引物Sl、l. 0 μ M下游内引物S2、3% (V/V) 二甲基亚砜、和ddH20。所述IXNEB buffer 2 为50mM NaClUOmM Tris-HClUOmM MgCl2、ImM 二硫苏糖醇、和 ddH20，pH 7. 9。所述引物Si、引物S2分别如SEQ ID NO 1和2所示。(2)链置换扩增反应液I :3% (V/V) 二甲基亚砜，0. lmg/mL牛血清白蛋白，浓度分别为 0. 2mM 的 dATP、dGTP 和 dTTP，1. OmM dCTP α S，1 XNEB buffer 2，和 ddH20。(3) Bst DNA 聚合酶(4)限制性内切酶BsoBI使用上述试剂盒检测单核细胞增生李斯特氏菌的方法，包括步骤(1)待检样品或细菌DNA的提取提取待检样品核酸，其中提取的样品DNA OD26tZOD28tl在1.6-2.0范围内，浓度在 IO-IOOng/μ L 范围内。(2)模板预处理程序取模板预处理反应液23 μ L，加入待检DNA 2 μ L，放入94°C水浴5min后迅速放入 590C的水浴中4 ；然后94°C水浴2 和59°C水浴4 过程反复进行6个以上循环；产物用作SDA模板。(3) SDA扩增将上述预处理的25 μ L模板溶液加入24. 2 μ L链置换扩增反应液I 中，95°C水浴加热5min，温度迅速冷却到0°C，然后加入0.4yL Bst DNA聚合酶与0.4yL BsoBI，置于59°C水浴反应Ih。(4)核酸凝胶电泳检测反应结束后，琼脂糖凝胶电泳检测；电泳板上出现IOObp的核酸扩增条带，说明待检样品为阳性，否则为阴性。本专利技术的试剂盒根据目标菌株的保守基因序列设计引物，保证检测方法的特异性。本专利技术采用改进的链置换扩增技术(SDA)技术，特异性强，具有与PCR检测方法相似灵敏度，但不需要昂贵的PCR仪，只需普通的水浴锅即可，检测方法简单、快速，特别适用于基层医疗机构及食品公司与相关检测部门。附图说明图1 其中，1单核细胞增生李斯特氏菌样品2单核细胞增生李斯特氏菌阳性对照 3阴性对照4 DNA Marker具体实施例方式SDA(Strand displacement amplification)反应是一种恒温、酶控的体外核酸扩增技术，主要依据限制性内切酶识别并切割半硫代磷酸化DNA的未修饰链以形成一个切口，在具有链置换能力的DNA聚合酶的作用下从切口处聚合延伸并取代下游DNA链。被置换下的单链DNA再与引物结合并由DNA聚合酶延伸成双链DNA。这种“切口一扩增一置换” 不断循环往复达到靶序列高效扩增的目的。基于上述原理，本专利技术提供的单核细胞增生李斯特氏菌的恒温扩增快速检测试剂盒，包括(1)模板预处理反应液(所列试剂均为在模板预处理反应液中的浓度)包括 IXNEB buffer 2，1.0μΜ 上游内引物(Si)、1. 0 μ M 下游内引物(S2)、体积比 3% DMSO(二甲基亚砜)、ddH20。所述IXNEB buffer 2 反应缓冲液成分为50mM NaClUOmM Tris-HClUOmM MgCl2UmM Dithiothreitol ( 二硫苏糖醇)、dH20，ρΗ 7. 9。单核细胞增生李斯特氏菌引物Sl 5' -CAGCCTGACACCAGACAA- CrCGGG-AAAGAAACTCCAGTAG "3' (SEQ ID NO 1)S2 5' -ACCGCATCGAATGCATGT- CTCGGG-AAATAGTGTCACCGCT -3' (SEQ ID NO 2)(注其中黑体部分为与单核细胞增生李斯特氏菌prfA基因片段匹配的序列)(2)链置换扩增反应液I 体积比3. 0 % DMSO, 0. lmg/mL BSA (牛血清白蛋白)，浓4度分别为 0. 2mM 的 dATP、dGTP 和 dTTP，1. OmM dCTP α S (购自 BIOLOG 公司(德国)、2，_deo xyeytidine-5' 0-(1-thiotriphosphate)), 1 XNEB buffer 2，ddH20o(3) Bst DNA Polymerase (购自 NewEnglandBiolabsLTD、链延伸 DNA 聚合酶、 8000U/mL)(4) BsoBI (购自 NewEnglandBiolabsLTD、限制性内切酶 BsoBI、10000U/mL)使用上述试剂盒检测单核细胞增生李斯特氏菌的方法，包括步骤(1)待检样品或细菌DNA的提取提取待检样品核酸，其中提取的样品DNA OD260/OD280在1. 6-2. O范围内，浓度在 IO-IOOng/μ L 范围内。(2)模板预处理程序取模板预处理反应液23 μ L，加入待检DNA 2 μ L，放入94°C水浴5min后迅速放入 590C的水浴中4 ；然后94°C水浴2 和59°C水浴4 过程反复进行6个以上循环；产物用作SDA模板。(3) SDA扩增将上述预处理的25 μ L模板溶液加入24. 2 μ L链置换扩增反应液 I中，95°C水浴加热5min，温度迅速冷却到0°C，然后加入0. 4yL Bst DNA Polymerase与 0. 4yL BsoBI，置于59 °C水浴反应Ih。(4)核酸凝胶电泳检测反应结束后，在反应管中加入6XLoading buffer (组分30mM EDTA ；36% (ν/ν) Glycerol ；0. 05% (w/v)Xylene Cyanol FF ；0. 05% (w/v)Bromophenol Blue),自然冷却至室温，用1. 5%琼脂糖凝胶电泳检测产物，IOO本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：尼秀媚，毕建秀，魏晓棠，梁炜，布岩，雷质文，张京宣，白桦，宋涛，姜英辉，纪瑛，
申请(专利权)人：山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：
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